ADN recombinante (ou rDNA) é feito através da combinação de ADN de duas ou mais fontes. Na prática, o processo envolve frequentemente a combinação do ADN de diferentes organismos. O processo depende da capacidade de cortar e voltar a juntar moléculas de ADN em pontos que são identificados por sequências específicas de bases nucleotídicas chamadas locais de restrição. Os fragmentos de ADN são cortados da sua posição normal no cromossoma usando enzimas de restrição (também chamadas endonucleases de restrição) e depois inseridos noutros cromossomas ou moléculas de ADN usando enzimas chamadas ligases.

Clonagem de Gene

Este processo descreve o processo de copiar fragmentos de ADN que podem depois ser usados para muitos propósitos diferentes, tais como criar culturas GM, ou encontrar uma cura para doenças. Existem dois tipos de clonagem genética: in vivo, que envolve o uso de enzimas de restrição e ligas usando vectores e clonando os fragmentos em células hospedeiras (como pode ser visto na imagem acima). O outro tipo é in vitro, que utiliza o método de reacção em cadeia da polimerase (PCR) para criar cópias de fragmentos de ADN.

Para clonagem in vivo, um fragmento de ADN, contendo um único gene ou um número de genes, é inserido num vector que pode ser amplificado dentro de outra célula hospedeira. Um vector é uma secção de ADN que pode incorporar outro fragmento de ADN sem perder a capacidade de auto-replicação, e um vector contendo um fragmento de ADN adicional é conhecido como um vector híbrido. Se o fragmento de ADN incluir um ou mais genes, o processo é referido como clonagem de genes.

Clonagem de ADN em Plasmídeos

Contribuinte: Genome Management Information System, Oak Ridge National Laboratory, E.U.A. Department of Energy Genome Programs http://genomics.energy.gov

Existem 4 tipos diferentes de vectores:

• vectores de lasmídio
• vectores de fago lamda (λ)
• Cosmids
• vectores de expressão

A célula hospedeira copia o ADN clonado utilizando os seus próprios mecanismos de replicação. Vários tipos de células são utilizados como hospedeiros, incluindo bactérias, células de levedura e células de mamíferos.

Reacção em cadeia da polimerase (PCR)

Fonte: Andy Vierstraete

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

Este é um método in vitro para fazer muitas cópias de uma secção específica de ADN, sem a necessidade de vectores ou células hospedeiras. O ADN a ser copiado – o ADN modelo – é misturado com primários para a frente e para trás complementares ao fim do ADN modelo, nucleótidos, e uma versão de DNA polimerase conhecida como Taq polimerase. (Esta enzima é estável sob altas temperaturas, e é obtida a partir da bactéria termófila Thermus aquaticus). O processo envolve a repetição de três etapas:

• desnaturação, que separa os dois fios de nucleótidos da molécula de ADN
• recozimento do primário, em que os primários se ligam ao ADN de cadeia única
• extensão, em que os nucleótidos são adicionados aos primários – na direcção de 5′ a 3′ – para formar uma cópia de cadeia dupla do ADN alvo.

Cada ciclo demora alguns minutos, e ciclos repetidos podem produzir grandes quantidades de uma sequência específica de ADN numa questão de horas em vez de dias. No entanto, este método de clonagem requer o conhecimento de alguns detalhes sobre a sequência nucleotídica a copiar, e a técnica é muito sensível a pequenas quantidades de contaminação.

Bibliotecas de Gene

Fonte: http://www.emunix.emich.edu/~rwinning/genetics/index.htm

Uma biblioteca de genes é uma grande colecção de sequências de ADN clonado de um único genoma. Uma biblioteca genómica, (como pode ser visto acima) em teoria, conteria pelo menos uma cópia de cada sequência no genoma de um organismo. Estes são utilizados para investigar a estrutura de um dado cromossoma, ou para clonar genes específicos. Estes tipos de bibliotecas podem ser preparados a partir de um subconjunto de todo o genoma (por exemplo, um único cromossoma). O primeiro passo na criação de uma biblioteca genómica é quebrar, ou ‘fracionar’, o genoma, utilizando métodos físicos ou enzimas de restrição. Os fragmentos são então ligados a vectores apropriados e clonados numa população adequada de células hospedeiras.

A biblioteca de cDNA (ADN complementar) contém ADN presente numa determinada população celular que é preparada a partir do mRNA (RNA mensageiro) utilizando a enzima transcriptase inversa. O cDNA resultante representa os genes expressos na população celular como um subconjunto de todo o genoma, e pode ser clonado usando um vector e célula hospedeira adequada (como se vê no diagrama acima). O cDNA não incluirá introns ou sequências reguladoras, uma vez que estes são removidos do RNA durante o processamento, e isto torna mais fácil a manutenção de uma biblioteca de cDNA. Uma biblioteca de cDNA também pode ser preparada utilizando a transcriptase reversa PCR (RT-PCR).

A Identificação de Produtos Genéticos numa Biblioteca Genética

Enzimas de restrição (para cortar o ADN) e electroforese em gel (para separar os fragmentos resultantes) podem ser usadas para produzir um mapa físico de segmentos de ADN num processo conhecido como mapeamento de restrição. Um exemplo do aspecto de um destes pode ser visto abaixo.

Source: Universidade de Leicester

Há também uma série de técnicas que podem ser utilizadas para identificar genes ou produtos genéticos específicos dentro de uma biblioteca genética, e estas são Mancha Sul, Mancha Norte e Mancha Oeste. No entanto, a técnica experimental mais poderosa para investigar a genética a nível molecular é a sequenciação do ADN, que permite determinar as sequências nucleotídicas dos genes – mesmo cromossomas inteiros -. As tecnologias de sequenciação automatizada estão agora a permitir-nos sequenciar todo o genoma de organismos, desde bactérias a seres humanos.

Genética molecular e biotecnologia

As novas técnicas de genética molecular, combinadas com desenvolvimentos em biotecnologias associadas, levaram a avanços numa série de campos diferentes. Podemos agora analisar os genomas das espécies que dão um contributo importante para a agricultura, produção de combustível ou desenvolvimento de medicamentos. Podemos mover genes específicos de um organismo para outro para criar plantas e animais transgénicos, e utilizar técnicas de clonagem animal para produzir animais geneticamente idênticos, como a ovelha Dolly, e mais recentemente, animais de estimação clonados como gatos e cães.

O processo de clonagem é simples, mas os resultados nem sempre são previsíveis. Foram necessárias muitas centenas de tentativas para que funcionasse e produzisse uma ovelha viva, e a clonagem em si levanta muitas questões não só sobre benefícios e riscos, mas também muitas questões éticas.

Diagrama de porcos para mostrar como a clonagem de animais é realizada. Source: National Human Genome Research Institute

A técnica de impressão digital genética, que permite a identificação de indivíduos e as relações entre indivíduos, encontrou muitas aplicações na ciência de hoje. Há também investigação em curso sobre a terapia genética que examina a possibilidade de introduzir genes clonados para compensar genes defeituosos e mutantes. E outras áreas, por exemplo, a clonagem humana e a investigação de células estaminais abrem muitas questões éticas que devem ser abordadas juntamente com os desenvolvimentos científicos.

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