Microscopia Confocal oferece muitas vantagens em relação à microscopia convencional de grande rendimento para aplicações das ciências da vida. Permite o controlo da profundidade de campo e a capacidade de recolher secções ópticas em série a partir de espécimes espessos. A microscopia confocal pode ser utilizada para criar imagens 3D das estruturas dentro das células. O exame destas estruturas pode ajudar os investigadores a observar o funcionamento interno dos processos celulares.
Nos microscópios ópticos convencionais de campo largo, a fluorescência secundária emitida de uma amostra ocorre frequentemente através do volume excitado e obscurece a resolução das características que se encontram no plano focal objectivo. Espécimes mais espessos exibem um grau de fluorescência tão elevado que se perde muito do detalhe. Técnicas de filtragem espacial eliminam a luz desfocada em amostras cuja espessura excede o plano imediato de foco.
Avanços em Microscopia Confocal
Varredura a laser multifocal e microscopia confocal em disco giratório permitem aos investigadores gerar imagens 3D de organelas dentro de células vivas. Imagens de alta qualidade podem ser obtidas a partir de espécimes preparados para microscopia convencional de fluorescência. Há também um número crescente de aplicações de biologia celular que requerem imagens tanto de células e tecidos fixos como vivos.
Avanços recentes na microscopia confocal tornaram possíveis vistas multidimensionais de células e tecidos vivos que incluem informação de imagens em 3D ao longo do tempo. Esta informação é apresentada em múltiplas cores. Ter dados temporais recolhidos de experiências de time-lapse ou através da aquisição de imagens em tempo real é uma ferramenta poderosa para a biologia celular. As capacidades da microscopia confocal aumentam à medida que novos sistemas laser estão a ser desenvolvidos para limitar os danos celulares e à medida que as velocidades de processamento e as capacidades de armazenamento do computador aumentam.
Laser Scanning Confocal Microscopy
A principal vantagem da microscopia confocal de varrimento a laser é produzir secções ópticas finas através de amostras fluorescentes que têm uma espessura superior a 50 micrómetros. As imagens são recolhidas através da coordenação de alterações incrementais no mecanismo de foco fino do microscópio (utilizando um motor passo-a-passo) com aquisição sequencial da imagem em cada passo.
Contraste e definição são grandemente melhoradas em relação a outras técnicas devido à redução da fluorescência de fundo e à melhoria do sinal para o ruído. Os artefactos que ocorreriam durante a secção física ou coloração fluorescente por secção óptica são também removidos. Os espécimes vivos podem ser examinados sob uma variedade de condições com maior clareza.
Microscopia confocal de disco giratório
O microscópio confocal de disco giratório permite às investigações utilizar níveis de luz mais baixos e obter uma fisiologia celular mais precisa com concentrações mais baixas de fluoróforos. Os benefícios de proporcionar imagens de maior eficiência com menores potências de laser incluem menos fotobleaching, fototoxicidade, e é menos dispendioso do que os microscópios de varrimento laser confocal.
As muitas vantagens que a microscopia confocal proporciona em relação à microscopia convencional de grande rendimento para aplicações das ciências da vida ajuda os investigadores a observar o funcionamento interno dos processos celulares.
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