Mechanismus der peritonealen Metastasierung

Der erste Schritt der peritonealen Metastasierung ist die Exfoliation der Eierstockkrebszellen aus dem Primärtumor in die Bauchhöhle. Die Voraussetzung für diesen Schritt ist der Verlust des Zell-Zell-Kontaktes zwischen den Krebszellen. Wie bereits erwähnt, kann das Ovarialkarzinom potenziell aus den Epithelzellen des Eileiters oder dem Oberflächenepithel der Eierstöcke entstehen. Beide exprimieren den klassischen Epithelmarker Epitheliales Cadherin (E-Cadherin) . E-Cadherin spielt durch seine Funktion als Zell-Zell-Adhäsionsmolekül eine Schlüsselrolle im Verhalten von Epithelzellen, in der Tumorsuppression und in der Gewebearchitektur. Es ist über α-, β- und γ-Catenine mit dem Aktin-Zytoskelett assoziiert. Während E-Cadherin direkt an der Bildung von Adherens Junctions zwischen benachbarten Epithelzellen beteiligt ist, kann es auch die Bildung von Tight Junctions und Desmosomen regulieren.

Wenn der Krebs von einer gutartigen zu einer bösartigen Form fortschreitet, durchlaufen die Zellen einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT). Dabei kommt es zu molekularen und morphologischen Veränderungen, bei denen sie ihre epithelialen Eigenschaften verlieren und mesenchymale Züge annehmen. Dies beinhaltet einen Verlust der kompakten Zell-zu-Zell-Anhaftung, der Polarität und der quaderförmigen Form. Die Zellen werden eher spindelförmig und beweglich. EMT beinhaltet auch eine Veränderung in der Expression von epithelialen und mesenchymalen Markern. Ein sehr wichtiger Aspekt dieses Übergangs ist der Verlust der Expression von E-Cadherin und ein gleichzeitiger Anstieg der Expression von neuralem Cadherin (N-Cadherin). Dies führt zu einer Verringerung der Zell-Zell-Interaktion zwischen den Krebszellen über ihre Adherens Junctions und zu einer Zunahme der Fähigkeit der Krebszellen, mit den normalen Stromazellen in der Mikroumgebung zu interagieren. Beim Ovarialkarzinom kann die E-Cadherin-Expression transkriptionell und post-transkriptionell reguliert werden. ZEB-1, ZEB-2, Snail und Slug sind dafür bekannt, E-Cadherin zu unterdrücken und können durch verschiedene externe Signale reguliert werden. Zu den Signalwegen, die die EMT und die E-Cadherin-Expression regulieren, gehören der transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β), der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), Endothelin-1 (ET-1) und das bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) . Darüber hinaus kann die miR-200-Familie von Mikro-RNAs auch indirekt die EMT regulieren, indem sie auf ZEB-1 und ZEB-2 abzielt, was zu einer Derepression von E-Cadherin führt. Eine verminderte Expression der miR-200-Familie führte zu einem Anstieg der Expression von ZEB-1 und ZEB-2, wodurch die E-Cadherin-Transkription unterdrückt und die EMT im Ovarialkarzinom induziert wurde.

Der Verlust der E-Cadherin-Expression und die daraus resultierende Abnahme der Zell-Zell-Bindung fördert die Ausbreitung der Zellen in die Peritonealhöhle. Interessanterweise wurde festgestellt, dass der Verlust der E-Cadherin-Expression zu einer Induktion der Expression von α5-Integrin führt. α5-Integrin bildet ein Heterodimer mit β1-Integrin, das an Fibronektin bindet und daher als Fibronektin-Rezeptor bezeichnet wird. Die Induktion von α5-Integrin erfolgte nicht über den kanonischen β-Catenin-Weg. Stattdessen erfolgte sie über den epithelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR)/fokale Adhäsionskinase (FAK)/mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) -Weg. Der Anstieg der Fibronektin-Rezeptor-Expression half den disseminierten Ovarialkarzinomzellen, sich an das von den Mesothelzellen, die das Omentum und Peritoneum auskleiden, sezernierte Fibronektin anzuheften. Dies ist ein Beweis dafür, wie der Verlust von E-Cadherin – der das Ablösen erleichtert – mit der Vorbereitung der Zellen auf die erneute Anheftung an der entfernten metastatischen Stelle gekoppelt ist.

Sobald die Krebszellen in die Peritonealflüssigkeit abgestreut wurden, wirkt sich dies signifikant auf die Prognose der Patientin aus, wie die Rückfallrate von 29 % bei Eierstockkrebs im Stadium 1A im Vergleich zu 59 % bei Stadium 1C zeigt. Sobald sie sich jedoch von der Tumormasse gelöst haben, stehen die Krebszellen vor mehreren Herausforderungen, um in der Peritonealflüssigkeit zu überleben. Die Peritonealflüssigkeit ist das Ergebnis einer kontinuierlichen Sekretion von Flüssigkeiten durch die Peritonealkapillaren. Dies hilft bei der Schmierung der angrenzenden Organe in der Peritonealhöhle und ermöglicht die Aufnahme von löslichen Faktoren durch das Peritoneum. Ein Großteil der Peritonealflüssigkeit wird über die Lymphdrainage in den Kreislauf zurückgeführt. Bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom führt jedoch die durch hohe Spiegel des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) induzierte erhöhte Undichtigkeit der Gefäße bei gleichzeitiger Blockade der Lymphgefäße durch Krebszellen zur Aszitesbildung . Dieser Aszites wird wegen der Anwesenheit von schwimmenden Krebszellen als maligner Aszites bezeichnet. Der maligne Aszites begünstigt die Ausbreitung der Krebszellen in der gesamten Bauchhöhle.

Die disseminierten Ovarialkarzinomzellen, die entweder als Sphäroide oder als Einzelzellen im Aszites schwimmen, entwickeln Resistenz gegen Anoikis und erwerben krebsstammzellähnliche Eigenschaften. Interessanterweise wurde festgestellt, dass die Einzelzellpopulation einen größeren Anteil an Krebsstammzellen aufweist. Die aus Aszites angereicherten Krebsstammzellen haben eine stark erhöhte Fähigkeit, Maus-Xenograft-Tumore zu bilden. Genau wie die Krebsstammzellen sind die schwimmenden Sphäroide und Einzelzellen resistent gegen Chemotherapie. Die kompakte Beschaffenheit der Sphäroide dient als zusätzliche physikalische Barriere für die Chemotherapeutika und verhindert, dass die inneren Zellen dem Medikament ausgesetzt werden. Zusammengenommen deutet dies darauf hin, dass die im Aszites schwimmenden Krebszellen stammartig und chemoresistent sind und das Potenzial haben, neue metastatische Tumore in der Bauchhöhle auszusäen.

Die Sphäroide weisen erhöhte Konzentrationen von E-Cadherin und EpCAM und gleichzeitig eine verringerte Expression von Vimentin, Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und CD44 auf. Daher zeigen die metastasierenden Krebszellen Plastizität in Bezug auf ihre Fähigkeit, zwischen epithelialen und mesenchymalen Phänotypen hin und her zu wechseln, je nach den Anforderungen der verschiedenen Schritte der Metastasierung. Zusätzlich zu den Krebszellen enthält der Aszites mehrere normale Zelltypen, die zusammen die maligne Aszites-Mikroumgebung bilden und die schwimmenden Krebszellen unterstützen. Zu den wichtigsten Nicht-Krebs-Zelltypen gehören krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs), Mesothelzellen, Immunzellen, mesenchymale Stammzellen und Blutplättchen . Diese Zellen können mit den Krebs-Sphäroiden oder den einzelnen Zellen assoziiert sein. Sie können auch alleine in der Peritonealflüssigkeit schwimmend existieren. Diese unterstützenden Zellen produzieren ein Milieu von Faktoren, die das Überleben der Krebszellen und die anschließende Besiedlung der metastatischen Stelle unterstützen. Zellen wie Thrombozyten bieten auch Schutz vor der Immunüberwachung, indem sie die Krebszellen ummanteln.

Nachdem die Metastasierung in der Peritonealflüssigkeit erfolgreich überlebt wurde, ist das nächste Ziel der metastasierenden Eierstockkrebszellen die Anheftung an die verschiedenen Organe in der Peritonealhöhle. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Schnitten des normalen Peritoneums und des Omentums haben die Architektur des sie bedeckenden Mesothels gezeigt. Das Mesothel besteht aus einer Monoschicht von Mesothelzellen, die sehr eng miteinander verbunden sind und eine Schutzbarriere bilden. Diese Mesothelzellen dienen dazu, eine glatte Oberfläche zu schaffen – durch die Sekretion von Glykosaminoglykanen und Schmierstoffen -, die die normale Bewegung des Coeloms erleichtert sowie Infektionen und das Anhaften von Krebszellen verhindert. Die Mesothelzellen können verschiedene Funktionen erfüllen, wie z. B. die Sekretion von ECMs, Wachstumsfaktoren und entzündlichen Zytokinen für die Gewebereparatur und -regeneration, Proteasen für die Fibrinolyse und die Verhinderung von Adhäsionen . Sie sind auch aktiv an der Bewegung von Flüssigkeiten und gelösten Stoffen durch Serosalhöhlen beteiligt.

Frühe In-vitro-Experimente zeigten, dass die Ovarialkarzinomzellen die Retraktion der Mesothelzellen bei Anheftung an das Mesothel erzwingen. In jüngerer Zeit haben Iwanicki et al. die Rolle des Fibronektin-Rezeptors (α5β1-Integrin) nachgewiesen, der auf der Oberfläche der Ovarialkarzinomzellen exprimiert wird und ihnen hilft, sich an das auf der Oberfläche der Mesothelzellen sezernierte Fibronektin anzuheften und die Verdrängung der Mesothelzellen durch Myosin-vermittelte Zugkräfte zu fördern. Nachfolgende Studien zeigten, dass Ovarialkarzinomzellen mit einem mesenchymalen Phänotyp eine größere Neigung zur Mesothelablösung haben . Es wurde festgestellt, dass die Fibronektin-Sekretion durch die Mesothelzellen durch ihre Interaktion mit den metastasierenden Ovarialkarzinomzellen induziert wird. Das von den Krebszellen sezernierte TGF-β aktivierte einen RAC1/SMAD-vermittelten Signalweg in den Mesothelzellen, was zu einer transkriptionellen Hochregulierung des Fibronektin-Gens führte und auch einen EMT-ähnlichen Phänotyp in den Mesothelzellen induzierte. Dies würde wahrscheinlich bei der anschließenden Mesothel-Clearance helfen und möglicherweise auch als Quelle für krebsassoziierte Fibroblasten in der Mikroumgebung des metastasierenden Tumors dienen.

Die erhöhte Expression des Fibronektin-Rezeptors in den Ovarialkarzinomzellen ist auch bei der Kopplung der Anheftung an die Wachstumsfaktor-Signalisierung zur Förderung der Metastasierung von Vorteil. Die Hemmung der Interaktion von α5β1-Integrin auf den Krebszellen mit dem Fibronektin auf der Oberfläche des Omentums und Peritoneums in Maus-Xenograft-Modellen der Ovarialkarzinom-Metastasierung führte zu einer verringerten Metastasenlast sowohl in der Prävention als auch in der Intervention . Da die Hemmung von α5β1-Integrin auch die Angiogenese hemmen kann, wurde weiter untersucht, ob die Auswirkungen auf die Metastasierung tatsächlich auf die Störung der Interaktion der humanen Krebszelle α5β1-Integrin mit Fibronektin oder die der Maus-Endothelzelle α5β1-Integrin zurückzuführen sind. Die Wirkung eines anti-murinen α5β1-Integrin-blockierenden Antikörpers wurde mit der des anti-humanen α5β1-Integrin-blockierenden Antikörpers verglichen. Interessanterweise zeigte der murine blockierende Antikörper keinen signifikanten Effekt und bestätigte damit die Schlüsselrolle der Interaktionen des α5β1-Integrins der Krebszelle mit dem Fibronektin der Mikroumgebung bei der Förderung der Metastasierung von Eierstockkrebs . Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Aktivierung von α5β1-Integrin zur Aktivierung und Phosphorylierung der Rezeptortyrosinkinase c-Met unabhängig von ihrem Liganden Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) führte. Diese durch Anheftung induzierte Aktivierung des Wachstumsfaktorrezeptors führte zu erhöhter Invasivität und Wachstum durch die nachfolgende Aktivierung der FAK/Src-Signalwege in den Krebszellen. Die Expression eines konstitutiv aktiven FAK konnte die hemmenden Effekte des α5β1-Integrin-blockierenden Antikörpers auf die Ovarialkarzinomzellen aufheben.

Ein weiterer Effekt der Adhäsion der Ovarialkarzinomzellen an der Oberfläche des Omentums ist die erhöhte Sekretion der extrazellulären Protease MMP-2. Sie spaltet das auf der Oberfläche des Mesothels vorhandene Fibronektin und Vitronektin in kleinere Fragmente, was die Bindung der Krebszellen an diese ECM über ihre spezifischen Integrinrezeptoren α5β1-Integrin bzw. αvβ3-Integrin verstärkt. Die Inhibition von MMP-2 in den Ovarialkarzinomzellen als Präventionsmaßnahme hemmte deren Adhäsion an das Omentum in Nacktmäusen. Allerdings spielte die Wirts-MMP-2 in diesem Prozess keine Rolle, wie Experimente mit MMP-2-Knockout-Mäusen zeigten.

Sobald sich die Krebszellen an die Mesothelzellen auf der Oberfläche des Omentums anheften, beginnen sie mit einem Prozess der Anpassung an die neue Mikroumgebung des Metastasierungsortes. Wie die oben beschriebenen Wechselwirkungen zwischen ECM und Krebszellen und ihre Folgen zeigen, sind produktivere wechselseitige Interaktionen zwischen den Krebszellen und ihrer neuen Mikroumgebung für die erfolgreiche Etablierung der metastatischen Tumoren unerlässlich. Die Krebszellen müssen von der überlebenden Anoikis, während sie in der Peritonealflüssigkeit schwimmen, zu einem angehefteten Wachstum in Anwesenheit von neuen ECMs und Wachstumsfaktoren, die in der Mikroumgebung des Omentums und Peritoneums verfügbar sind, übergehen. Dies beinhaltet signifikante Veränderungen in den Genexpressionsprofilen der kolonisierenden Krebszellen und würde daher die Aktivierung/Repression von transkriptionellen/translationalen Regulatoren in Abhängigkeit von Mikroumgebungsfaktoren beinhalten. Ein solcher wichtiger mikroumgebungsgesteuerter Translationsregulator ist die Mikro-RNA miR-193b. miR-193b ist eine Tumorsuppressor-Mikro-RNA, die bei metastasierendem Ovarialkarzinom nach Interaktion mit den Mesothelzellen, die die Oberfläche des Omentums bedecken, herunterreguliert wurde. Diese Herunterregulierung förderte das Wachstum und die Invasivität der Krebszellen in vitro, die Besiedlung des menschlichen Omentums ex vivo und verringerte die Metastasierung in Maus-Xenografts. Interessanterweise wurde die miR-193b-Downregulation durch die Hypermethylierung seines Promotors als Ergebnis des Cross-Talks zwischen den Krebszellen und den Mesothelzellen induziert. Die Hypermethylierung des Promotors wurde durch die erhöhte Expression von DNMT1 in den Krebszellen katalysiert, die durch die Interaktion mit dem Mesothel stimuliert wurde. miR-193b wurde als direktes Ziel von Urokinase gefunden. Eine Abnahme der miR-193b-Expression führte zu einer erhöhten Expression von Urokinase, die die funktionellen Effekte von miR-193b bei der metastatischen Besiedlung des Omentums vermittelte.

Wenn sich die Krebszellen an die neue Mikroumgebung der metastatischen Stelle anpassen und zu proliferieren beginnen, rekrutieren sie auch residente und nicht-residente normale Zellen und wandeln sie in das tumorassoziierte Stroma oder „aktiviertes Stroma“ um. Es ist bekannt, dass die Tumoren zu 10-50 % aus Nicht-Krebszellen oder dem Tumorstroma bestehen. Die wichtigsten Komponenten dieses Tumorstromas sind die krebsassoziierten Fibroblasten (CAFs), tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) und andere Immunzellen, Endothelzellen, Perizyten, Adipozyten, extrazelluläre Matrixproteine usw. . All diese Stromakomponenten sind für das erfolgreiche Wachstum und die Progression der Tumore essentiell, da sie eine kritische Quelle für Wachstums- und Tropikfaktoren sind, bei der Umgehung der Immunüberwachung, der Angiogenese, dem ECM-Umbau, der Invasivität usw. helfen. Daher hängt der letztendliche Erfolg der Krebszellen bei der Besiedlung des Omentums von ihrer Fähigkeit ab, ein aktives Tumorstroma zu entwickeln.

Die metastasierenden Ovarialkarzinomzellen rekrutierten die residenten normalen Fibroblasten in der Basalmembran des Omentums und programmierten sie in CAFs um. Diese Umprogrammierung wurde durch die verringerte Expression von miR-214, miR-31 und einen Anstieg der Expression von miR-155 in den normalen Fibroblasten, die durch die Krebszellen induziert wurden, angetrieben. Die resultierenden CAFs förderten die Migration, Invasion und Koloniebildung von Eierstockkrebszellen in vitro und das Tumorwachstum und die Metastasierung in vivo. Interessanterweise konnten CAFs durch die kombinierte Überexpression von miR-214 und miR-31 und Hemmung von miR-155 wieder in normale Fibroblasten umgewandelt werden. Die Mikro-RNAs vermittelten ihre Effekte über eine Reihe von Targets, von denen die meisten als Chemokine und Zytokine identifiziert wurden. Als Hauptvermittler erwies sich CCL5, das ein direktes Ziel von miR-214 war. Die Hemmung von CCL5 in Nacktmäusen, denen eine Mischung aus Ovarialkarzinomzellen und CAFs injiziert wurde, verringerte signifikant die Fähigkeit der CAFs, das Tumorwachstum und die Metastasierung zu fördern.

Eine wichtige und reichlich vorhandene zelluläre Komponente des Omentums sind Adipozyten. Bis vor kurzem war nicht viel über die direkte Rolle der omentalen Adipozyten bei der Förderung der Metastasierung von Ovarialkarzinomen in das Omentum bekannt, obwohl bekannt ist, dass das Omentum einer der Hauptorte der Metastasierung von Ovarialkarzinomen ist und dass es sich dabei um ein überwiegend fetthaltiges Gewebe handelt. Die Arbeitsgruppe von Dr. Lengyel wies nach, dass die omentalen Adipozyten Adipokine absondern, die die Ansiedlung der metastasierenden Eierstockkrebszellen im Omentum fördern. Die Krebszellen konnten daraufhin eine metabolische Umprogrammierung der Adipozyten einleiten und in ihnen eine Lipolyse induzieren. Die Adipozyten wiederum induzierten die Expression von FABP4 – einem Fettsäuretransporter – in den Krebszellen. Dadurch nehmen die Krebszellen die von den Adipozyten freigesetzten freien Fettsäuren effizient auf und nutzen sie als Energiequelle und Bausteine für das Tumorwachstum. Dies erklärt, warum der Omentum-Tumor in der Regel der größte in der Peritonealhöhle ist, wobei sich manchmal das gesamte Omentum in einen festen, harten Omentalkuchen verwandelt. Zu diesem Zeitpunkt sind alle Adipozyten aufgebraucht und für das Wachstum des metastatischen Tumors verwendet worden.