Zelluläre DNA wird ständig durch verschiedene endogene und exogene Agenzien oxidiert, und die daraus resultierenden DNA-Schäden können das Risiko der Entwicklung von Krebs und anderen Krankheiten erhöhen. Guanin hat das niedrigste Redoxpotential der vier DNA-Basen und wird daher am leichtesten oxidiert.

Während der DNA-Replikation induziert der Einbau von Adenin gegenüber einem Guanin-Oxidationsprodukt eine G:C-T:A-Transversion, während der Einbau von Guanin gegenüber einem Guanin-Oxidationsprodukt eine G:C-C:G-Transversion verursacht. Diese Mutationen (siehe Referenzen in ) finden sich in vielen wichtigen Genen, insbesondere an CpG-Stellen im Tumorsuppressor-Gen p53 und in den Codons 12 und 13 des K-ras-Onkogens . Daher ist es wichtig, den Nukleotideinbau und die DNA-Verlängerung für jedes Guanin-Oxidationsprodukt zu analysieren, um die Mechanismen aufzuklären, die der Entstehung von G:C-T:A- und G:C-C:G-Transversionen zugrunde liegen.

8-Oxo-7,8-dihydroguanin (8-oxoG) (Abb. 1) ist eine der häufigsten oxidativen DNA-Läsionen und wird unter verschiedenen oxidativen Bedingungen gebildet. 8-OxoG wurde ausgiebig untersucht, hat eine signifikante biologische Wirkung und ist ein ubiquitärer Marker für oxidativ geschädigte DNA . Strukturanalysen haben gezeigt, dass 8-OxoG entweder eine anti oder syn Konformation annimmt: 8-OxoG in der anti Konformation bildet Watson-Crick Basenpaare mit Cytosin, während die Läsion in der syn Konformation die Hoogsteen-Kante der Läsion nutzt, um ein Basenpaar mit Adenin zu bilden (Abb. 2). Außerdem bauen DNA-Polymerasen Adenin zusätzlich zu Cytosin gegenüber 8-oxoG ein, und 8-oxoG induziert eine G:C-T:A-Transversion in Escherichia coli (E. coli) und Säugetierzellen.

Obwohl 8-oxoG G:C-T:A-Transversionen verursacht, kann der Mechanismus, der der Entstehung von G:C-C:G-Transversionen zugrunde liegt, nicht durch 8-oxoG erklärt werden. Darüber hinaus wird 8-oxoG aufgrund seines geringeren Oxidationspotentials leichter oxidiert als Guanin, so dass verschiedene oxidative Läsionen durch die Oxidation von 8-oxoG entstehen. Daher ist es notwendig, sowohl 8-oxoG als auch andere oxidierte Guanin-Läsionen zu untersuchen, um die verschiedenen Phänomene zu verstehen, die durch Guanin-Oxidation verursacht werden.

Guanin-Oxidationsprodukte, die G:C-C:G-Transversionen verursachen, bilden Basenpaare durch Wasserstoffbrückenbindungen mit Guanin

Wie bereits erwähnt, wird die G:C-C:G-Transversion durch den Einbau von Guanin gegenüber einem Guanin-Oxidationsprodukt verursacht. In diesem Abschnitt beschreiben wir zunächst die „A-Regel“. Adenin ist die häufigste Base, die von DNA-Polymerasen gegenüber einer abasischen Stelle eingebaut wird, was darauf hindeutet, dass Adenin von den vier natürlichen Basen die meisten hydrophoben Interaktionen bildet und die beste räumliche Kompatibilität mit einer abasischen Stelle aufweist. Der Einbau von Adenin erfordert nicht unbedingt die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen mit verschiedenen beschädigten DNA-Stellen in der Template-DNA. Im Gegensatz dazu erfordert die bevorzugte Insertion von Guanin zusätzlich zu den hydrophoben Wechselwirkungen und der räumlichen Kompatibilität die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen mit der Template-Base. Um die Läsionen aufzudecken, die G:C-C:G-Transversionen verursachen, ist es daher wichtig, Guanin-Oxidationsprodukte zu untersuchen, die durch Wasserstoffbrückenbindungen mit Guanin Basenpaare bilden.

Potenzielle Guanin-Oxidationsprodukte, die G:C-C:G-Transversionen verursachen

Iz wird langsam zu 2,2,4-Triamino-5(2H)-oxazolon (Oz) hydrolysiert (Abb. 1) in neutraler wässriger Lösung, und seine Halbwertszeit beträgt 147 min unter physiologischen Bedingungen . Zusätzlich werden 2-6 Moleküle Oz pro 107 Guaninbasen in der Leber-DNA nachgewiesen, und es wurde kürzlich gezeigt, dass die Menge von Oz in Gegenwart von 5-Methylcytosin signifikant erhöht ist. Daher ist der biologische Einfluss von Oz bei der DNA-Replikation wahrscheinlich größer als der von Iz.

Klenow-Fragment exo- baut in vitro Adenin gegenüber Oz ein, und Oz verursacht G:C-T:A-Transversionen in E. coli . Im Gegensatz dazu baut das Klenow-Fragment exo- in unserem in vitro Reaktionssystem entweder Adenin oder Guanin gegenüber Oz ein. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die DNA-Polymerasen α, β, δ und ε jeweils nur Guanin gegenüber Oz inkorporieren; die DNA-Polymerasen γ, κ und die Sulfolobus solfataricus DNA-Polymerase IV zusätzlich zum Klenow-Fragment exo- jeweils Guanin und Adenin inkorporieren; die DNA-Polymerase η Guanin, Adenin und Cytosin inkorporiert; die DNA-Polymerasen ζ und ι jeweils Guanin, Adenin, Cytosin und Thymin inkorporieren; und REV1 Cytosin inkorporiert. Diese Analysen zeigen, dass die DNA-Polymerasen, außer REV1, Guanin gegenüber Oz einbauen. Wir haben vorhergesagt, dass Oz ein stabiles Basenpaar mit Guanin bilden kann und dass dieses Oz:G Basenpaar zwei Wasserstoffbrückenbindungen hat und planar ist (Abb. 3c). Wir haben kürzlich Experimente zur thermischen Denaturierung durchgeführt und berichtet, dass das Basenpaar Oz:G thermodynamisch stabiler ist als Oz:A, Oz:C und Oz:T.

Zudem verlängern die DNA-Polymerasen α, β, γ, δ, ε, η, κ und ζ jeweils den Primer über Oz hinweg auf volle Länge. Oz scheint also eine oxidierte Läsion zu sein, die mit der Induktion von G:C-C:G-Transversionen zusammenhängt. Insbesondere elongiert die DNA-Polymerase ζ jenseits von Oz mit fast der gleichen Effizienz wie jenseits von G , aber nicht jenseits von Tetrahydrofuran (THF; ein chemisch stabiles Analogon der abasischen Stelle), 8-oxoG oder O 6-Methylguanin . Diese Daten deuten darauf hin, dass die DNA-Polymerase ζ eine effektive, fehleranfällige Replikationspolymerase für Oz ist. Außerdem baut nur REV1 Cytosin gegenüber Oz ein, und die Häufigkeit der Cytosineinfügung folgt der Reihenfolge Oz > Guanidinohydantoin (Gh) > THF > 8-oxoG . Da REV1 mit DNA-Polymerasen interagieren kann, legen die bisherigen Ergebnisse nahe, dass REV1 zusammen mit der DNA-Polymerase ζ G:C-C:G-Transversionen verhindern könnte. Solche Systeme zur Verhinderung von Mutationen werden auch bei anderen DNA-Polymerasen gesehen.

Reaktion von oz-haltigen Oligonukleotiden mit Reparaturenzymen

Zellen nutzen eine Reihe von Mechanismen, um mutagene Effekte der oben beschriebenen Arten von DNA-Schäden zu verhindern, und verfügen über verschiedene Enzyme, die DNA-Schäden wie 8-oxoG reparieren.

E. coli Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase und Endonukleasen III Enzyme schneiden Oz aus doppelsträngigen DNA-Oligomeren heraus . Darüber hinaus entfernen die menschlichen NTH1 und NEIL1, die Homologe der E. coli Endonukleasen III und VIII sind, Oz ebenso effizient wie 5-Hydroxyuracil, und ihre Reaktivität gegenüber Oz ist höher als gegenüber 8-oxoG . Da Oz empfindlicher als 8-oxoG auf die Behandlung mit Piperidin reagiert, hängt dieser Unterschied in der Reaktivität von der Stärke der N-glykosidischen Bindung ab.

Wir analysierten die Schnittaktivitäten anderer Reparaturenzyme an Oz. Die Chlorella-Virus-Pyrimidin-Dimer-Glykosylase, die eine Schnittaktivität gegenüber Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren aufweist, reagiert mit Oz-haltiger doppelsträngiger DNA. Die Reaktivität gegenüber Oz ist höher als gegenüber 8-oxoG, was darauf hindeutet, dass die Reaktivität von der Stärke der N-glykosidischen Bindung abhängig ist, ähnlich wie bei menschlichem NEIL1 und NTH1 . Dieses Reparaturenzym zeigt jedoch eine mäßige Aktivität gegenüber Oz im Vergleich zu seiner Aktivität gegenüber Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer.

Die Endonuklease IV, eine apurinische/apyrimidinische Endonuklease, zerschnitt Oz mit einer beobachteten Aktivität, die ein Drittel bis ein Viertel der Aktivität gegenüber THF betrug, jedoch mit größerer Effizienz als ihre Aktivität gegenüber Gh. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Oz einer abasischen Stelle strukturell ähnlicher ist als Gh.

Die Endonuklease V, die eine Aktivität gegenüber Hypoxanthinresten aufweist, ist auch gegenüber Oz aktiv. Diese Aktivität ist bei hohen Konzentrationen der Endonuklease V geringer als die gegenüber Hypoxanthin, aber die Endonuklease V erkennt Oz viel effizienter als Gh. Endonuklease V kann Uracil, aber nicht Thymin erkennen, was darauf hindeutet, dass die 5′-Methylgruppe für die Erkennung durch Endonuklease V kritisch ist. Wie bereits beschrieben, hat Gh im Gegensatz zur geschlossenen Ringstruktur von Oz (Abb. 1) eine aus dem Ring herausragende Einheit, ähnlich wie Thymin. Daher kann die Endonuklease V Oz, aber nicht Gh erkennen.

Menschliche OGG1 und AP-Endonuklease 1 können keine Oz-Reste schneiden, und die monofunktionelle Uracil-DNA-Glykosylase 1, die nur einen Strang selektiert, zeigt keine Schnittaktivität gegenüber Oz (Daten nicht gezeigt). E. coli Mut Y kann nicht auf Oz:G- und Oz:A-Läsionen wirken (Daten nicht gezeigt). Oz ist ein schwaches Substrat für die menschliche Nukleotid-Exzisionsreparatur, weil die beschädigte Stelle weniger sperrig ist als die von Pyrimidin-(6-4)-Pyrimidon-Photoprodukten, was es für XPC-RAD23B schwierig macht, Oz zu erkennen.

Die bisher verfügbaren Daten deuten darauf hin, dass menschliches NEIL1 und NTH1 die wahrscheinlichsten Reparaturenzyme für Oz sind. Jedoch können menschliches NEIL1, NTH1, E. coli Endonukleasen III und Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase alle Oz aus doppelsträngiger DNA herausschneiden, unabhängig von der Art der Base gegenüber Oz . Wenn die Base gegenüber Oz vor der Basen-Exzisionsreparatur Adenin, Guanin oder Thymin ist, wird die genetische Information in nachfolgenden Replikationen verändert. Es könnte also unbekannte Enzyme geben, die Oz genau von Oligonukleotiden entfernen können, in denen Oz an ein C gepaart ist, so wie das menschliche OGG1 8-oxoG entfernen kann. Alternativ kann, wie bereits erwähnt, die REV1-DNA-Polymerase ζ G:C-C:G-Transversionen verhindern.

Behindert OzOz die DNA-Synthese durch DNA-Polymerasen?

Kontinuierliche Guanine (GG), die in vielen wichtigen genomischen Regionen wie dem K-ras Onkogen vorkommen, werden aufgrund ihres geringeren Redoxpotentials leichter oxidiert als ein einzelnes Guanin. Die Oxidation von GG-Sequenzen unter hohen Oxidationsbedingungen führt zu einer zusammenhängenden oxidierten Guanin-Läsion. Wir haben bereits berichtet, dass IzIz durch die Oxidation von GG in einzel- und doppelsträngiger DNA produziert wird, was darauf hindeutet, dass die Hydrolyse dieser Iz-Moleküle zwei zusammenhängende Oz-Moleküle (OzOz) produziert. Es wird erwartet, dass OzOz die DNA-Synthese effektiver abwürgt als ein einzelnes Oz und somit einen schwerwiegenderen DNA-Schaden darstellt als ein einzelnes Oz.

Unsere Analyse zeigte, dass die DNA-Polymerase κ kein Nukleotid gegenüber OzOz einbaut. Klenow-Fragment exo baute bevorzugt ein Adenin gegenüber dem 3′ Oz der OzOz-Läsionen ein, REV1 baute Cytosin ein, und DNA-Polymerase β baute Guanin ein. DNA-Polymerase α inkorporierte Guanin, Adenin und Cytosin gegenüber den 3′ Oz von OzOz-Läsionen, wobei Guanin leichter inkorporiert wurde als Adenin und Cytosin. Die DNA-Polymerase ι baute Guanin, Adenin und Thymin leicht ein. Unabhängig davon, ob eine Base inkorporiert wird oder nicht, können diese Polymerasen den Primer nicht bis zur vollen Länge über OzOz verlängern.

Im Gegensatz dazu verlängerte die DNA-Polymerase η den Primer bis zur vollen Länge über OzOz-Läsionen mit bescheidener Effizienz im Vergleich zu über Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer-Läsionen, wobei die Synthese der meisten DNA-Stränge am 3′ oder 5′ Oz von OzOz zum Stillstand kam. Im Gegensatz dazu konnte die DNA-Polymerase ζ den Primer effizient bis zur vollen Länge über OzOz verlängern, was darauf hindeutet, dass die DNA-Polymerase ζ ein wichtiges Enzym für die Translesionssynthese sowohl an einzelnen als auch an zusammenhängenden Oz-Molekülen vorbei ist. Darüber hinaus baut die DNA-Polymerase ζ alle Nukleotide gegenüber dem 3′ und 5′ Oz ein und ist eine fehleranfällige DNA-Polymerase für OzOz.

Photooxidation in Quadruplex-DNA

Guanin-reiche Sequenzen wie Telomere können sich zu Quadruplex-Strukturen falten. In doppelsträngiger DNA ist die Ein-Elektronen-Oxidation von Guanin in zusammenhängenden Guanin-Sequenzen abhängig von der Lokalisierung des höchstbesetzten Molekülorbitals (HOMO) . Im Gegensatz zur doppelsträngigen DNA wird das 3′-Guanin von d(TGGGGT) in der Quadruplex-DNA hauptsächlich oxidiert, und das geschätzte HOMO ist auf dem 3′-Guanin lokalisiert (Abb. 4b). Angesichts unseres derzeitigen Verständnisses von doppelsträngiger DNA und Quadruplex-DNA findet die selektive Ein-Elektronen-Oxidation von Guanin unabhängig von der DNA-Struktur am lokalisierten HOMO statt.

Auf der anderen Seite sind die Guanin-Oxidationsprodukte abhängig von der DNA-Struktur. Zum Beispiel ist Iz ein Hauptprodukt in einzelsträngiger DNA, während 8-oxoG und Dehydroguanidinohydantoin (Ghox) hauptsächlich in Quadruplex-DNA gebildet werden. Iz, 8-oxoG, Ghox und Gh werden in doppelsträngiger DNA gebildet und sind ebenfalls Hauptoxidationsprodukte in einzelsträngiger und quadruplexer DNA.

Der Mechanismus der Guanin-Oxidation in einzelsträngiger, doppelsträngiger und quadruplexer DNA kann wie folgt erklärt werden. Die Ein-Elektronen-Oxidation von Guanin erzeugt ein Guanin-Radikal-Kation (G-+), gefolgt von zwei Abbauwegen (Abb. 5). In einem Weg wird G-+ an der N1-Position deprotoniert, gefolgt von der Bildung von Iz. In einem anderen Weg wird G-+ hydratisiert und deprotoniert, gefolgt von der Bildung von 8-oxoG, Ghox und Gh. Zwischen dem N1-Proton von G-+ und dem O6 von Guanin in Quadruplex-DNA besteht eine Wasserstoffbrücke (Abb. 6a), und zwischen dem N1-Proton von G-+ und dem N3 von Cytosin in doppelsträngiger DNA wird eine Wasserstoffbrücke gebildet (Abb. 6b). Daher ist die Deprotonierung von G-+ in Quadruplex-DNA signifikant gehemmt und in doppelsträngiger DNA teilweise gehemmt. Wir schätzen, dass die Leichtigkeit der Deprotonierung der Reihenfolge folgt: einzelsträngige DNA > doppelsträngige DNA > Quadruplex-DNA , und diese Reihenfolge erklärt die Unterschiede in den Oxidationsprodukten in jeder Art von DNA-Struktur.