Cardellini erhielt ihre erste große Rolle 1996, als sie eine Hauptrolle als Sarah in der Samstagmorgen-Live-Action-Kinderserie „Bone Chillers“ von ABC ergatterte. Danach hatte sie Gastauftritte in Prime-Time-Serien wie Step by Step, Clueless, 3rd Rock from the Sun und Boy Meets World als Lauren, ein Mädchen, das zwischen das Starpaar der Serie geriet. Cardellini spielte 1999 die Hauptrolle in der ersten Staffel der AMC-Serie The Lot und verbrachte den Sommer in Europa als Teil einer Tournee-Produktion von Lancelot, einer niederländischen Tragödie aus dem vierzehnten Jahrhundert.
Cardellini hatte ihren ersten großen Erfolg, als sie eine der Hauptrollen in der NBC-Serie „Freaks and Geeks“ ergatterte, die in der Saison 1999-2000 debütierte. Als Lindsay Weir, eine Musterschülerin inmitten einer Identitätskrise, erntete Cardellini positive Resonanz, die sie in der Folge zum Ruhm katapultierte. Cardellini spielte 2002 die Hauptrolle in der Live-Action-Adaption von Scooby-Doo, in der sie die Zeichentrickfigur Velma Dinkley spielte. Später wiederholte sie die Rolle der Velma in Scooby-Doo 2: Monsters Unleashed von 2004. 2003 stieß sie zur Besetzung des Krankenhausdramas ER als Samantha Taggart, eine freigeistige Krankenschwester. Cardellini spielte sechs Staffeln lang in ER mit, bis zum Serienfinale „And in the End…“, und gewann mit der Besetzung 2009 den TV Land Ensemble Icon Award.
Zu ihren weiteren Filmarbeiten gehören Rollen in Dead Man on Campus, Strangeland, Good Burger, Legally Blonde, Brokeback Mountain (für den sie für den Ensemble Gotham und Screen Actors Guild Award nominiert wurde) und eine Hauptrolle in dem Happy Madison Film Grandma’s Boy als Samantha. Sie war die Stimme von Ursula in dem Rollenspiel-Videospiel Gladius und spielte die Stimme von Bliss Goode in der ABC-Zeichentrickserie The Goode Family. 2007 wurde Cardellini ausgewählt, die liebeskranke Clara in der CBS-Miniserie Comanche Moon zu spielen, einem Prequel zu Lonesome Dove von 1989.
In den Jahren 2010 und 2011 kehrte Cardellini mit der Comedy-Gruppe Dr. God in Los Angeles und San Francisco auf die Bühne zurück, trat in Kill the Irishman und Super auf und spielte die Hauptrolle in dem Independent-Film Return. Sie trat mit Darstellern und Produzenten von Freaks and Geeks und Undeclared beim Paley Center for Media PaleyFest am 12. März 2011 auf. Vom 15. Juni 2012 bis zum 15. Februar 2016 war sie die Stimme von Wendy in der Disney Channel Show Gravity Falls.
Cardellini spricht regelmäßig in der Podcast- und Live-Show The Thrilling Adventure Hour, in den Sparks Nevada: Marshal on Mars-Segmente. Im Jahr 2013 wurde sie ausgewählt, Sylvia Rosen zu spielen, ein Liebesinteresse von Don Draper auf Mad Men. Für ihre Darstellung in Mad Men erhielt sie eine Nominierung für den Primetime Emmy Award als Herausragende Gastdarstellerin in einer Dramaserie. Ab 2015 spielte sie zusammen mit Kyle Chandler in der neuen Netflix-Dramaserie Bloodline, die von den Machern von Damages stammt. Die Serie wurde 2016 abgesetzt und endete nach ihrer dritten Staffel. Im selben Jahr hatte sie auch eine Hauptrolle als Sara Whitaker in der Filmkomödie Daddy’s Home. Im Jahr 2017 nahm sie ihre Rolle in der Fortsetzung Daddy’s Home 2 wieder auf.
Im August 2018 wurde Cardellini als Co-Star mit Christina Applegate in der Netflix-Serie Dead to Me besetzt. Die Serie feierte am 3. Mai 2019 Premiere. Für ihre Darstellung erhielt sie viel Lob von der Kritik und eine Nominierung für den Primetime Emmy Award als Outstanding Lead Actress in a Comedy Series.
Im Jahr 2019 spielte sie die Hauptrolle in dem Horrorfilm The Curse of La Llorona.