Späte Prophase, oder Prometaphase, beginnt mit dem Aufbrechen der Kernhülle, die in kleine Membranbläschen zerfällt, die dem endoplasmatischen Retikulum sehr ähnlich sind und meist um die mitotische Spindel herum sichtbar bleiben. Während dieser Zeit kondensieren die Chromosomen weiter und verkürzen und verdicken sich allmählich, bis sie vollständig die Einheiten gebildet haben, die die Mitose durchlaufen werden. Auch der Nukleolus, der in einigen Zellen noch vorhanden sein kann, verschwindet in der Prometaphase vollständig.

Das obige digitale Fluoreszenzmikroskopie-Bild zeigt eine einzelne Rattenkänguru-Nierenzelle (PtK2) in den frühen Stadien der Prometaphase. Das Chromatin ist mit einer blau fluoreszierenden Sonde (DAPI) angefärbt, während das Mikrotubuli-Netzwerk (mitotische Spindel) grün (Alexa Fluor 488) und die zellulären Mitochondrien mit einem roten Farbstoff (MitoTracker Red CMXRos) angefärbt sind. Während der Prometaphase sind die Mikrotubuli der mitotischen Spindel nun frei, um in die Kernregion einzudringen, und die Bildung von spezialisierten Proteinkomplexen, die als Kinetochoren bekannt sind, beginnt an jedem Zentromer. Diese Komplexe werden an eine Untergruppe der Spindelmikrotubuli angehängt, die dann als Kinetochor-Mikrotubuli bezeichnet werden. Andere Mikrotubuli in der Spindel (die nicht an den Zentromeren befestigt sind) werden als polare Mikrotubuli bezeichnet, und diese helfen bei der Bildung und Aufrechterhaltung der Spindelstruktur zusammen mit astralen Mikrotubuli, die außerhalb der Spindel verbleiben.

Die Grenze zwischen Prophase und Prometaphase wird durch den schnellen Beginn der Phosphorylierung in der gesamten Kernlamina bestimmt, ausgelöst durch die Aktivierung eines Enzyms, das als Mitose-induzierende Proteinkinase (abgekürzt MPF) bezeichnet wird. Der Kernmembrankomplex zerfällt daraufhin in Vesikel und legt die kondensierten Chromosomen dem expandierenden Mikrotubuli-Netzwerk der mitotischen Spindel frei. Im Lichtmikroskop lassen sich die Kernmembranbläschen, die von ähnlichen disaggregierten Teilen des endoplasmatischen Retikulums kaum zu unterscheiden sind, in der Region um die wachsende Spindel sichtbar machen.

Wenn die Kinetochor-Mikrotubuli an ihren Rezeptoren auf den Kinetochoren der Chromatiden ansetzen, werden die Chromosomen in eine unruhige Bewegung gebracht und bewegen sich unter der Spannung der Spindel schnell hin und her. Gleichzeitig interagieren polare Mikrotubuli, die von den Zentrosomen ausgehen, miteinander, um ein Verbindungsnetzwerk zwischen den Chromosomen zu bilden und die Struktur der mitotischen Spindel weiter zu etablieren. Die Kinetochoren werden am Zentromer jedes Chromatids zusammengefügt, so dass zwei Kinetochoren pro Chromosom entstehen. Schließlich, in der Anaphase, ziehen die Kinetochoren-Mikrotubuli die Schwesterchromatiden zu den entgegengesetzten Polen der mitotischen Spindel, um sicherzustellen, dass jede Tochterzelle ein vollständiges genetisches Komplement an Chromosomen erhält.

Die Komplexität der Beziehung zwischen Kinetochoren und der mitotischen Spindel spiegelt die Anforderung an eine genaue Verteilung des genetischen Materials zwischen sich teilenden Zellen wider. Der häufigste Fehler in der Mitose ist die fehlende Trennung der Schwesterchromatiden, was dazu führt, dass eine der beiden Tochterzellen beide Chromosomenkopien erhält. Dieser Fehler, der etwa einmal in 100.000 Zellteilungen auftritt, kann auftreten, wenn Chromatiden nicht am richtigen Spindelpol anhaften oder wenn ein Chromatidenpaar nur an einem Pol anhaftet. In manchen Fällen werden die beiden Schwesterchromatiden zwar korrekt im mitotischen Spindelapparat zusammengefügt, trennen sich aber in der Anaphase einfach nicht.