DISKUSSION

Die Nukleinsäure-Amplifikation mittels RT-PCR oder anderen Techniken bietet eine genauere Diagnose von EV-Meningitis als bisher verfügbare Techniken wie z. B. Viruskultur. Mit der Verfügbarkeit dieser empfindlichen Diagnosetechniken werden jetzt viele Liquorproben zur EV-Nukleinsäureuntersuchung eingereicht. Wir haben das Liquorprofil, einschließlich der Leukozytenzahl und des Proteingehalts, überwacht, um die Leistung der in unserem Labor verwendeten EV-RT-PCR zu beurteilen. Wir haben nun die Daten analysiert, die auf Proben basieren, die für die EV-RT-PCR während des 3-Jahres-Zeitraums von 2001 bis 2003 eingereicht wurden, um die Beziehung zwischen Liquor-Parametern und dem Vorhandensein einer EV-Infektion des zentralen Nervensystems (ZNS) neu zu bewerten. In einem dieser Jahre kam es in unserer Region zu einem großen Ausbruch von WNV, so dass wir die Auswirkungen des Vorhandenseins eines anderen neurotropen Erregers auf die Beziehung zwischen Anomalien im Liquorprofil und dem möglichen Vorhandensein von EV-RT-PCR bewerten konnten. Unsere Ergebnisse können für Kliniker und Labormitarbeiter nützlich sein, die ihren Einsatz von EV-Nukleinsäuretests optimieren wollen.

Der Schwerpunkt unserer Studie war die Beziehung zwischen der Leukozytenzahl im Liquor und den Ergebnissen der EV-RT-PCR. Wir waren daran interessiert, den Anteil der Patienten zu bestimmen, die sowohl eine EV-ZNS-Infektion als auch eine erhöhte Liquor-Leukozytenzahl aufwiesen. Außerdem wollten wir den Anteil der Patienten mit erhöhten Leukozytenzahlen im Liquor bestimmen, die auf eine EV-Infektion zurückzuführen sind. Unsere Daten zeigen, dass diese beiden Anteile stark vom Alter beeinflusst werden. Der Befund einer fehlenden Liquorpleozytose in Liquorproben, die positiv für EV-RNA waren, war weitgehend auf Säuglinge unter 2 Monaten beschränkt und war in dieser Altersgruppe recht häufig (28 %), was wahrscheinlich die immunologische Unreife dieser Patienten widerspiegelt. Es ist verlockend zu spekulieren, dass eine Chemokin-Antwort, die für die Rekrutierung von Leukozyten zum Ort der Infektion erforderlich ist, bei diesen Patienten noch nicht entwickelt war. Bei älteren Patienten fehlte bei weniger als 2 % der Patienten mit einer EV-Infektion des ZNS eine Pleozytose. Umgekehrt war der Befund einer Liquor-Pleozytose mit negativer EV-RT-PCR bei Proben von älteren Patienten häufiger. Es überrascht nicht, dass dieser Befund auch häufiger während der Saison auftrat, in der ein größerer Ausbruch von WNV-Erkrankungen in dem Gebiet unseres Labors auftrat.

Vorangegangene kleinere Studien haben sich ebenfalls auf einen Vergleich von EV-RT-PCR-Ergebnissen und Liquorparametern konzentriert. Henquell et al. (5) berichteten über 61 Patienten mit Symptomen einer Meningitis und verglichen EV-Kultur- und PCR-Ergebnisse mit Liquorbefunden. Sechsundfünfzig der 61 Patienten (92 %) waren PCR-positiv, aber 9 Patienten, die >1,5 Jahre alt waren, hatten Liquor-Zellzahlen von <10 Zellen/mm3 und waren PCR- oder Kultur-positiv. Somit war in ihrer Studie die Korrelation zwischen Pleozytose und EV-RT-PCR-Positivität nicht gut. Böttner et al. (2) berichteten über eine Kohorte von 70 Patienten mit Symptomen einer Meningitis im Sommer 2000. In dieser Studie waren 29 (46 %) von 61 EV-RT-PCR-Tests auf Liquor positiv. Die Zellzahlen im Liquor reichten von 2 bis 1.820 Zellen/mm3, mit einem Mittelwert von 151. Die Autoren berichteten, dass es keine Unterschiede in den Laborbefunden zwischen den Patienten in ihrer Studie gab, die EV RT-PCR-positiv waren und denen, die negativ waren, aber sie gaben keine detaillierten Liquor-Zellzahlen an. Die Erklärung für die Unterschiede zwischen den Ergebnissen dieser Studien und der vorliegenden Studie ist nicht klar, aber sie könnte biologische Unterschiede in den nachgewiesenen EVs oder unterschiedliche Leistungsmerkmale der EV-RT-PCR-Assays widerspiegeln.

Einer der interessanten Aspekte der vorliegenden Studie ist es, die Aufmerksamkeit auf die Ursachen der Liquor-Pleozytose bei Patienten zu lenken, deren EV-RT-PCR-Assay negativ ist. Eine mögliche Erklärung ist, dass der Assay möglicherweise nicht alle EV-Infektionen erkennt. Wir kennen nicht die tatsächliche analytische (molekulare) Sensitivität des Chemicon-Assays in Bezug auf seine Fähigkeit, geringe Mengen viraler RNA nachzuweisen. Wir haben die Sensitivität untersucht und festgestellt, dass sie in der Größenordnung des 2,0-fachen der 50%igen Gewebekultur-Infektionsdosis liegt, aber wir wissen nicht, wie viele EV-Genome dies darstellt, und es ist auch nicht bekannt, wie viele nicht-infektiöse Partikel bei einer akuten Infektion im menschlichen Liquor produziert werden. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass dies die einzige Erklärung ist, da in unserer Studie 21 von 148 Patienten (14 %), die ≤2 Monate alt waren, und 169 von 549 Patienten (31 %), die >2 Monate alt waren, eine Pleozytose aufwiesen und EV RT-PCR negativ waren. Die Primer und die Sonde, die in unserer Studie verwendet wurden, haben gezeigt, dass sie alle bis auf 6 der 64 bekannten EVs, die den Menschen infizieren, erkennen (13). Ein EV, das Coxsackievirus A15, stand für den Test nicht zur Verfügung, und zwei andere, die mit dieser Primer- und Sondenkombination nicht nachgewiesen wurden, die Echoviren 22 und 23, wurden inzwischen als Parechoviren reklassifiziert (16). Die sechs nicht nachgewiesenen EVs sind epidemiologisch selten. Andere Infektionen, wie HSV, EBV und WNV, wurden bei einigen der Patienten mit Pleozytose diagnostiziert, machten aber nur 18 Infektionen oder 23 % aller Patienten in dieser Studie mit Pleozytose und einer negativen EV-RT-PCR im Jahr 2002 aus (n = 77). Es ist möglich, dass einige der verbleibenden Patienten Infektionen mit anderen Infektionserregern hatten, wie z. B. Parechoviren (16). Zusätzlich können einige der beobachteten Fälle von Pleozytose in dieser Studie auf nicht-infektiöse Ursachen der Pleozytose zurückzuführen sein, einschließlich Reaktionen auf Medikamente wie Cotrimoxazol, nicht-steroidale entzündungshemmende Mittel und intravenöses Immunglobulin. Eine bakterielle Harnwegsinfektion wurde ebenfalls als Ursache für eine Liquor-Pleozytose bei Kindern in Betracht gezogen (18).

Die Verwendung von Liquor-Proteinwerten als Indikator für eine EV-RT-PCR-Positivität wurde in Betracht gezogen. Die Daten zeigten jedoch, dass der Liquor-Proteinspiegel weder sensitiv noch spezifisch war, wenn er allein verwendet wurde, noch erhöhte er die Sensitivität oder Spezifität, wenn er in Verbindung mit der Pleozytose verwendet wurde. Die Receiver-Operating-Characteristic-Kurven zeigten, dass der Liquor-Proteinspiegel allein bei keinem der untersuchten Cutoff-Werte eine Spezifität von mehr als 80 % aufwies, und in keiner Altersgruppe und bei keinem der drei von uns untersuchten Werte waren sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität größer als 80 %. Die beste Korrelation zwischen Liquor-Proteinspiegeln und EV-RT-PCR-Positivität trat bei Patienten auf, die >2 Monate alt waren, bei 80 % des normalen Cutoffs, wo die Sensitivität 68 % und die Spezifität 78 % betrug.

Die Zirkulation von WNV in der Gemeinschaft während der EV-Saison 2002 war möglicherweise ein Störfaktor bei der Verwendung von Liquormarkern als Korrelate der EV-RT-PCR-Positivität. In der Tat bestätigen die z-Test-Daten in Tabelle33 , dass es signifikante Unterschiede zwischen den Daten aus den Saisons 2001 und 2002 hinsichtlich der Spezifität der Pleozytose allein oder der Pleozytose und/oder des erhöhten Proteinspiegels als Korrelate der EV-RT-PCR-Positivität gab, möglicherweise aufgrund der Präsenz von WNV in St. Louis während der Saison 2002. Im Jahr 2002 gab es 67 Liquorproben von Patienten, die >2 Monate alt waren und eine Pleozytose aufwiesen, die durch EV PCR negativ waren. Von diesen waren 10 (15 %) positiv für WNV und 18 (27 %) waren entweder für WNV oder ein anderes Virus positiv. Wenn alle 18 dieser Falsch-Positiven aus den Berechnungen von 2002 entfernt wurden, stiegen Spezifität und PPV von 56 % bzw. 23 % auf 63 % und 29 %. Die Spezifität und der PPV für alle Proben von Patienten, die im Jahr 2001 >2 Monate alt waren, lagen bei 62 % bzw. 66 %. Das Entfernen der falsch-positiven Ergebnisse, die auf das Vorhandensein anderer Viren zurückzuführen sind, erklärt immer noch nicht den Rückgang des PPV von 2001 auf 2002. Es müssen andere unbekannte Faktoren am Werk sein. Somit verringert das Vorhandensein einer anderen (infektiösen oder anderen) Ursache für eine Liquor-Pleozytose in der Gemeinschaft die Fähigkeit des Labors, eine EV-Positivität auf der Grundlage von Liquor-Befunden vorherzusagen.

Zusätzlich zur Fokussierung der Aufmerksamkeit auf die Liquor-Pleozytose-Ursachen, die nicht auf eine EV-Infektion zurückzuführen sind, haben die Ergebnisse dieser Studie zwei praktische Anwendungen. Die erste ist, dass Labore, die EV-RT-PCR durchführen, den Vergleich der RT-PCR-Ergebnisse mit Liquor-Zellzahlen nutzen können, um Metriken zu entwickeln, die als Teil eines Qualitätssicherungsprogramms für diesen Assay verwendet werden können. Basierend auf unserer Erfahrung ist eine Metrik, dass die EV-RT-PCR bei ca. 75 % der Säuglinge unter 2 Monaten mit Liquor-Pleozytose, bei ca. 65 % der Säuglinge und Kinder im Alter von 2 Monaten bis 18 Jahren mit Liquor-Pleozytose und bei ca. 25 % der Patienten über 18 Jahren mit Liquor-Pleozytose positiv sein sollte. Diese Zahlen wurden unter Verwendung von Daten aus den beiden Jahreszeiten abgeleitet, in denen WNV entweder nicht oder nicht sehr häufig vorkam. Die Zirkulation von bekannten oder neuen Arboviren oder anderen Viren, die Meningitis verursachen können, sollte bei der Analyse von Daten in Bezug auf diese Messgröße berücksichtigt werden, da dies zu einer Verringerung des Anteils von Patienten mit Pleozytose führt, die ein positives EV-RT-PCR-Ergebnis haben. Labore, die diesen Standard nicht erfüllen, können davon profitieren, die analytische Sensitivität ihres Assays zu untersuchen, sollten aber auch auf das mögliche Vorhandensein anderer Erreger achten, die eine Liquor-Pleozytose verursachen könnten.

Eine zweite Metrik, die zur Qualitätskontrolle verwendet werden kann, ist, dass der EV-RT-PCR-Assay bei ca. 98 % der Patienten über 2 Monaten, die keine Liquor-Pleozytose haben, und bei ca. 70 % der Patienten unter 2 Monaten ohne Pleozytose negativ sein sollte. Der Nachweis von EV-RNA bei einem größeren Prozentsatz von Patienten ohne Pleozytose sollte Labore dazu veranlassen, zu überlegen, ob möglicherweise eine PCR-Kontamination vorliegt. Es sollte jedoch beachtet werden, dass diese Prozentsätze wahrscheinlich von einer Region zur anderen, von einer Patientenpopulation zur anderen, von einem diagnostischen Assay zum anderen und von einer Jahreszeit zur anderen variieren, möglicherweise in Abhängigkeit von den zirkulierenden EVs.

Die zweite praktische Anwendung der Ergebnisse aus der vorliegenden Studie ist, dass Labore diese Daten nutzen können, um Kriterien zur Maximierung der Effizienz von EV-RT-PCR-Tests festzulegen. Da z. B. das Fehlen einer Pleozytose einen Vorhersagewert von mehr als 98 % für ein negatives RT-PCR-Ergebnis bei Patienten im Alter von mehr als 2 Monaten hat, können Labore einen Grenzwert für EV-RT-PCR-Tests basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen einer Pleozytose festlegen. Unter Verwendung der Daten aus der vorliegenden Studie hätte die Anwendung dieses Cutoffs zum Ausschluss von 223 von 549 Proben geführt (basierend auf den 549 Proben von Patienten, die >2 Monate alt waren und für die Liquor-Zellzahlen verfügbar waren), wobei nur 3 positive Proben (1,3 %) nicht erkannt worden wären, die sich in der ausgeschlossenen Gruppe von 223 Proben befunden hätten. Die drei Patienten mit EV-Infektion, aber ohne Pleozytose, waren 5 Monate, 10 Jahre und 15 Jahre alt. Bei einem dieser Patienten (dem 10-Jährigen) bestand aufgrund eines steifen Halses der Verdacht auf eine EV-Meningitis, aber die beiden anderen hatten Symptome, die weniger eindeutig mit einer Meningitis assoziiert waren. Der 10-jährige Patient wäre wahrscheinlich aufgrund des klinischen Verdachts und nicht aufgrund der Liquor-Pleozytose auf EV getestet worden, aber die beiden anderen wären möglicherweise nicht getestet worden. Bei allen drei Fällen hatte das positive EV-PCR-Ergebnis keinen signifikanten Einfluss auf das Fallmanagement. Wenn eine Maßnahme wie die von uns vorgeschlagene angenommen wird, empfehlen wir, sie auf Patienten im Alter von mehr als 2 Monaten anzuwenden und sicherzustellen, dass ein Mechanismus existiert, der Tests in Einzelfällen mit einem starken klinischen Verdacht auf eine EV-Infektion ermöglicht, unabhängig vom Alter des Patienten oder dem Vorhandensein einer Liquorpleozytose. Offensichtlich ist ein Screening-Programm auf Basis der Liquor-Pleozytose nur für Labore praktikabel, deren Zugang zu Liquor-Zellzahldaten ausreichend schnell ist, so dass die Anwendung des Screening-Kriteriums die Durchführung des Assays nicht verzögern würde. Frühere Studien haben deutlich gezeigt, dass EV-Assays sehr zeitnah durchgeführt werden müssen, um einen Einfluss auf die klinische Entscheidungsfindung zu haben (14).