Ergebnisse und Diskussion

Die dreidimensionale Struktur von Mal d 1.0101 besteht aus einem gekrümmten, siebensträngigen antiparallelen β-Faltblatt (β1-β7), das eine lange Helix am C-Terminus des Proteins (α3) und zwei aufeinanderfolgende kurze Helices (α1, α2) umfasst (Abbildung Abbildung 11). Die Kanten des β-Faltblattes werden durch die Stränge β1 und β2 gebildet, die durch die Helices α1 und α2 verbunden sind, die eine V-förmige Stütze für den C-terminalen Teil der Helix α3 bilden. Insgesamt enthält Mal d 1 ca. 35 % β-Faltblatt- und ca. 25 % Helixstruktur, was gut mit Sekundärstrukturschätzungen aus Infrarot- und Zirkulardichroismus übereinstimmt.33-35 Wie in anderen Proteinen der PR-10-Familie sind die Stränge β2 und β3 durch ein glycinreiches Schleifenmotiv verbunden (Gly46-Asn47-Gly48-Gly49-Pro50-Gly51).Zusammen bilden diese Strukturelemente den großen internen Hohlraum, der typisch für die kanonische PR-10-Faltung ist. Aus Abbildung11B ist ersichtlich, dass in unseremNMR -Strukturensemble von Mal d 1 die Sekundärstrukturelemente in allen 20 Strukturmodellen sehr gut definiert und konformationell homogen sind. Nur für einige der lösungsmittelexponierten Schleifen, die die Sekundärstrukturelemente und den C-Terminus des Proteins verbinden, werden leicht erhöhte Werte der konformationellen Heterogenität beobachtet.

Eine Besonderheit der PR-10-Faltung ist der große interne Hohlraum.

In Mal d 1.0101 beträgt das Volumen dieses Hohlraums36 ca. 2230 Å3, was in der Größe mit denen anderer PR-10-Proteine vergleichbar ist.5 Wie bei dem Birkenpollenallergen Bet v 1 und anderen homologen Nahrungsmittelallergenen ist auch bei Mal d 1 die Mehrzahl der Aminosäuren, die die Oberfläche des Hohlraums bilden, hydrophob (Abbildung22). Ein großer Teil der inneren Hohlraumoberfläche wird durch Aminosäurereste im β-Faltblatt gebildet, deren hydrophobe Seitenketten sich im Proteininneren befinden (Ile56 (β3), Val67(β4), Ile71 (β4), Tyr81 (β5), Tyr83 (β5),Leu85 (β5), Ile98 (β6), Tyr100 (β6), Ile113 (β7))sowie nach innen gerichtete Reste in der langen amphiphilen Helixα3 (Val132, Val134, Ala139, Leu142, Phe143, Ile146), den beiden kurzen Helices α1 (Phe22, Val23) und α3 (Ala26, Ile30) und Schleifenbereichen (Ile38, Phe58, Tyr64, Ala90). Zusätzlich befinden sich einige polare und geladene Seitenketten im Inneren des Moleküls und bilden einen Teil der Hohlraumoberfläche, wie z. B. Asp27 (α2), His69(β4), Ser115 (β7) und Lys138 (α3), so dass der Hohlraum selbst tatsächlich amphiphil ist, wie bereits für das Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1 festgestellt wurde.37 In Kristallstrukturen anderer PR-10-Proteine wird der Hohlraum von Wasser, amphiphilen Ligandenmolekülen oder Komponenten des Kristallisationspuffers besetzt.5 Für Mal d 1 ist derzeit nicht bekannt, ob Liganden spezifisch an den Hohlraum binden oder was die biologische Funktion der Ligandenbindung sein könnte.

(A) Interner Hohlraum vonMal d 1.0101, eingefärbt nach dem lipophilen Potential, wie es in MOE implementiert ist,32 wobei die hydrophilen Bereiche blau und die lipophilen Bereiche gelb eingefärbt sind. (B) Oberflächendarstellung der Lösungsstruktur mit niedrigster Energie von Mal d 1.0101. Die beiden amphiphilen Eingänge zum inneren Hohlraum sind als ε1 (zwischen dem N-terminalen Ende der Helix α3 und den Schleifen, die die Stränge β3-β4 und β5-β6 verbinden) und ε2 (zwischen der Kante desβ-Faltblattes und dem C-terminalen Ende der Helix α3) gekennzeichnet.

Der innere Hohlraum in Mal d 1 kann durch zwei Öffnungen erreicht werden (Abbildung Abbildung22). Ein Eingang zum Proteininneren, ε1, wird durch Reste in der N-terminalen Hälfte der Helix α3 (His131, Val134) zusammen mit den Schleifen, die die Stränge β3-β4 (Gln63, Tyr64) und die Stränge β5-β6 (Asp89) verbinden, gebildet. Zusammen bilden diese Aminosäuren eine amphiphile Zugangsroute zum Proteininneren. Ein zweiter amphiphiler Zugang, ε2, befindet sich am Rand des β-Faltblattes zwischen der Helix α3(Lys136, His140, Lys144 und Glu147) und dem Strang β1 (Asn7, Phe9 und Ser 11). In den NMR-Lösungsstrukturen von Mal d 1 ist dieser Zugangsweg durch die Seitenkette von His140 teilweise versperrt. Bemerkenswerterweise wurden Zugänge zum inneren Hohlraum an ähnlichen Stellen auch für andere Mitglieder der PR-10-Proteinfamilie beschrieben.5

Abbildung33 zeigt einen Vergleich von Mal d 1 mit Bet v 1 und birkenpollenverwandten Nahrungsmittelallergenen aus der PR-10-Familie, deren Strukturen bisher bestimmt wurden.38 Trotz der Tatsache, dass die Sequenzidentitäten zwischen diesen Proteinen in einigen Fällen nur geringfügig höher als 50 % sind, sind ihre dreidimensionalen Strukturen im Allgemeinen sehr ähnlich, wobei die rmsd-Werte der Rückgrat-Sekundärstrukturen typischerweise unter 2 Å liegen.38 In Anbetracht der beobachteten immunologischen Kreuzreaktivität zwischen Mal d 1 und dem Birkenpollen-Hauptallergen Bet v 1 ist der Strukturvergleich dieser beiden Proteine von besonderem Interesse. Der Backbonermsd zwischen Mal d 1.0101 und der hyperallergenen Isoform Bet v 1.0101(61% Sequenzidentität) des Birkenpollenallergens beträgt 2,13 Å(1,70 Å für Sekundärstrukturelemente). Bemerkenswert ist, dass sich Mal d 1 und Bet v 1 in der Länge um eine Aminosäure unterscheiden, und dass unterschiedliche Vermutungen über die Lage der Lücke in Mal d 1 angestellt worden sind. Auf der Grundlage von Sequenzalignments von PR-10-Lebensmittelallergenen wurde vorgeschlagen, dass entweder die Schleife direkt vor39,40 oder direkt nach4,34,41,42 Strang β7 in Mal d 1 um einen Rest kürzer ist. Unsere Lösungsstruktur zeigt, dass die Schleife direkt vor Strang β7 diejenige ist, die in Mal d 1.0101 kürzer ist. Die Stränge β6 (Glu96-Val105 sowohl in Mal d 1.0101 als auch in Bet v 1.0101) und β7 (Ser111-Thr121 in Mal d 1.0101 und Ser112-Thr122 in Bet v 1.0101) besetzen identische Positionen und haben gleiche Wasserstoffbrückenbindungsmuster in den antiparallelenβ-Sheets dieser Proteine. Sie sind über Schleifen verbunden, die aus vier Resten (Cys-Gly-Ser-Gly in Mal d 1) bzw. fünf Resten (Thr-Pro-Asp-Gly-Glyin Bet v 1) bestehen, was zu einem kleinen strukturellen Unterschied in diesen Schleifensegmenten zwischen den beiden Proteinen führt.

Mal d 1 neigt bekanntermaßen zur Cystein-vermittelten Dimerisierung, wie für die Isoform Mal d 1.0108 durch nicht-reduzierende Gelelektrophorese und Größenausschlusschromatographie gezeigt wurde.35 Wie Mal d 1.0108 enthält auch die Isoform Mal d 1.0101 eine einzelne Cysteinerreidue, Cys107. In der dreidimensionalen Lösungsstruktur von Mal d 1.0101 befindet sich Cys107 an der C-terminalen Spitze des Strangs β7, wobei seine Seitenkette zur Proteinoberfläche hin orientiert ist. Um den Oligomerisierungszustand von Mal d 1.0101 unter den Bedingungen zu untersuchen, die wir für die NMR-Strukturbestimmung verwendet haben (pH 6,9, 10 mM Sodiumphosphat, 14 mol-Äquiv. l-Ascorbinsäure, 298 K), führten wir Puls-Feldgradienten-NMR-Diffusionsexperimente durch. Wir erhielten einen Wert von 21,6 ± 0,8 Å für den hydrodynamischen Radius von Mal d 1.0101, der mit dem hydrodynamischen Radius von monomerem Bet v1.0101 (20,1 Å) unter ähnlichen experimentellen Bedingungen vergleichbar ist.21 Dies stimmt mit unserer Beobachtung überein, dass Mal d 1.0101 unter Verwendung desselben Puffers aus einer Größenausschlusssäule mit einer Retentionszeit eluiert, die praktisch identisch mit der von Bet v1.0101 ist. Diese Ergebnisse wurden außerdem durch FT-ICR-Massenspektrometrie verifiziert, die zeigt, dass Mal d 1.0101 keine Dimere oder Aggregate höherer Ordnung bildet.

Die NMR-Lösungsstruktur von Mal d 1 zeigt, dass dieses Protein aus einem stark gekrümmten antiparallelen β-Faltblatt und drei α-Helices besteht, die einen großen internen Hohlraum bilden, der anderenPR-10-Proteinen sehr ähnlich ist.5 Dies steht im Einklang mit der beobachteten immunologischen Kreuzreaktivität zwischen Mal d 1 und dem wichtigsten Birkenpollenallergen, Bet v 1, sowie anderen Nahrungsmittelallergenen aus der PR-10-Proteinfamilie.4,43 Bei den meisten Patienten ist Bet v 1 das sensibilisierende Agens, während Bet v 1-spezifische IgE-Antikörper in der Folge mit Mal d 1 kreuzreagieren und eine allergische Reaktion auslösen, wie die klinische Beobachtung zeigt, dass sich eine Apfelallergie erst nach dem Auftreten einer Birkenpollinose entwickelt.44

In diesem Sinne zeigten Kreuzinhibitionsexperimente von Mal d 1 mit Äpfeln von Apfelallergikern, dass Mal d 1 IgE-Epitope mit dem Hauptallergen der Birkenpollen, Bet v 1, teilt.4,43 Aus struktureller Sicht sind nur begrenzte Informationen über die genaue Natur der Bindungsepitope von Mal d 1 und Bet v 1 verfügbar. Detaillierte strukturelle Informationen über ein sequentiell diskontinuierliches (d. h., B-Zell-Epitop in Bet v 1 wurden durch Cokristallisation der speziellen Form Bet v 1.0112 mit einem Antigen-bindenden Fragment (Fab) des murinen monoklonalen IgG-Antikörpers BV16 gewonnen.45 Dieses Epitop wird durch das Segment zwischen Glu42 und Thr52 (einschließlich des glycinreichen Schleifenmotivs zwischen den Strängen β2 und β3) sowie Arg70, Asp72, His76, Ile86 und Lys97 von Bet v 1 gebildet und bedeckt ca. 10% (≈900 Å2) der gesamten Proteinoberfläche. Die Bindung von BV16 an dieses Epitop reduziert messbar die Serum-IgE-Interaktionen, was darauf hindeutet, dass IgE und monoklonales IgG BV16 um überlappende Bindungsoberflächen auf Bet v 1 konkurrieren.46 Darüber hinaus reduzierte die Mutation eines zentralen Restes (Glu45→Ser) signifikant die IgE-Bindungskapazität von Bet v 1, was die Bedeutung dieses speziellen Epitops für die Interaktionen mit IgE bestätigt.46

Abbildung44A zeigt die molekulare Interaktionsoberfläche, die dem BV16-Epitop im Apfelallergen entspricht. In Mal d 1 bilden diese Reste zusammen mit einem etwas distalen Rest (Glu76) ein zusammenhängendes Oberflächenfeld, das in Form und Größe dem BV16-Epitop von Bet v 1 ähnelt. Außerdem sind die beitragenden Aminosäuren zwischen Mal d 1 und Bet v 1 weitgehend konserviert. Dreizehn der 16 Aminosäuren im BV16-Epitop sind identisch, während sich nur 3 Reste in Mal d 1.0101 und Bet v 1.0101 unterscheiden (Abbildung 44B). Diese Daten liefern somit eine strukturelle Erklärung für die beobachtete allergische Kreuzreaktivität zwischen Birkenpollen und Apfelallergenen. Interessanterweise deuten Mutationsstudien darauf hin, dass die Fähigkeit von Mal d 1, Serum-IgE von Patienten mit Birkenpollenallergien zu binden, durch Erhöhung der Ähnlichkeit des BV16-Epitops in Mal d 1 mit dem von Bet v 1 erhöht werden kann, was darauf hindeutet, dass diese Aminosäuren tatsächlich an der Bindung von Bet v 1 spezifisch an Mal d 1 beteiligt sind.39

(A) Konformationalepitope von Mal d 1. Aminosäurereste, die der molekularen Interaktionsfläche zwischen monoklonalemIgG BV16 und Bet v 1.0112 entsprechen (Reste Glu42-Thr52, Arg70, Asp72,Glu76, Ile86 und Lys97 in Mal d 1.0101) sind blau eingefärbt.45 Aminosäurepositionen, die sich in Mutationsanalysen als entscheidend für die IgE-Erkennung von Mal d 1 erwiesen haben (Thr10, Ile30, Thr57, Ser111, Thr112 und Ile113), sind grün eingefärbt (Ile30 und Ile113 befinden sich im Inneren des Proteins und tragen nicht zur Oberfläche bei).13,34 (B) Aminosäureähnlichkeiten zwischen Bet v 1.0101 und Mal d 1.0101 unter Verwendung eines Farbverlaufs von lila (hochgradig ähnlich) bis teal (hochgradig unähnlich). Epitopreste, die sich zwischen Bet v 1.0101 und Mal d 1.0101 unterscheiden, sind markiert. Die Ähnlichkeiten wurden auf der Basis von Substitutionsmatrix-Scores (BLOSUM62) berechnet, wie sie in MOE implementiert sind.32

Es ist wahrscheinlich, dass Mal d 1 mehr als ein einziges Konformationspitop enthält.47 Eine Reihe von Aminosäurepositionen, die für die IgE-Erkennung relevant sind, wurden durch Mutationsanalysen identifiziert.13,34 Für eine Fünf-Punkt-Mutante von Mal d 1.0108(Thr10→Pro, Ile30→Val, Thr57 →Asn, Thr112→Cys,und Ile113→Val) wurde in vitro eine deutlich reduzierte Kapazität zur Bindung von Mal d 1-spezifischem IgE gefunden.34 Hautsticheltests bei Apfelallergikern, bei denen Wildtyp Mal d 1 mit der Fünf-Punkt-Mutante verglichen wurde, zeigten außerdem eine signifikant geringere Fähigkeit des mutierten Proteins, in vivo Hautreaktionen auszulösen.48 Weitere Experimente zeigten, dass das T-Zell-Erkennungsniveau von Wildtyp Mal d 1 in der Fünf-Punkt-Mutante erhalten bleibt.34 Da diese fünf Aminosäuren wahrscheinlich nicht nur in Mal d 1, sondern auch in Bet v 1 an IgE-Interaktionen beteiligt sind, könnten sie durchaus Teil gemeinsamer kreuzreagierender Epitope in diesen beiden Allergenen sein.49 Dies wird durch Mutationsstudien bestätigt, die zeigten, dass Peptidabschnitte, die diese Reste umfassen, tatsächlich an der immunologischen Kreuzreaktivität zwischen Mal d 1 und Bet v 1 beteiligt sind.50 Darüber hinaus wurde in einer unabhängigen Studie Ser111 als essentiell für die IgE-Bindung an Mal d 1 identifiziert, und eine Ser111→Cys-Mutation führte zu einer signifikant verringerten Affinität für IgE in Immunoblotting-Experimenten.13

Abbildung44A zeigt, dass diese sechs Reste ziemlich verstreut auf der Proteinoberfläche von Mal d 1 liegen und dass keine dieser Aminosäuren mit demBV16 -Epitop überlappt. Die Aminosäuren Thr10, Ser111 und Thr112 bilden einen gemeinsamen Fleck auf der Proteinoberfläche, während Thr57 etwa 37-39 Å entfernt und in der Nähe des BV16-Epitops angeordnet ist. Wenn man bedenkt, dass ein Epitop von typischer Größe (∼600-900 Å2)39 und kreisförmiger Form eine Bogenlänge von 28-34 Å auf der Mal d 1 Oberfläche haben würde, sind die ResteThr10, Ser111 und Thr112 wahrscheinlich zu weit von Thr57 entfernt, um Teil eines gemeinsamen Bindungsepitops zu sein. Die verbleibenden zwei Reste, Ile30und Ile113, erreichen die Proteinoberfläche in Mal d 1 nicht. Während Ile113 räumlich nahe am Thr10-Ser111-Thr112-Patch liegt, ist seine hydrophobe Seitenkette zum Inneren des Proteins gerichtet, wo sie an einem kleinen hydrophoben Kern am inneren Ende des Proteinhohlraums (zwischen den Helices α1 und α3 und dem β-Faltblatt) beteiligt ist. Der Rest Ile30 befindet sich ebenfalls im Proteininneren, wobei seine aliphatische Seitenkette einen Teil des inneren Hohlraums bildet und nicht zur Proteinoberfläche beiträgt.

Da die Schleife zwischen den Strängen β6 und β7 in Mal d 1 um einen Rest kürzer ist als in Bet v 1, besetzen Ser111 und Thr112 von β7 in Mal d 1 die β7-Positionen von Ser112 und Ile113 in Bet v 1. Der Oberflächenfleck, der von Thr10, Ser111 und Thr112 in Mal d 1 gebildet wird, scheint also weniger hydrophob zu sein als der entsprechende Oberflächenfleck in Bet v 1 (Thr10, Ser112 und Ile113). Tatsächlich zeigt auch die Proteinoberfläche, die diese drei Reste umgibt, einen deutlich geringeren Grad an Ähnlichkeit zwischen Mal d 1.0101 und Bet v 1.0101 als andere Teile der Proteinoberfläche, wie in Abbildung 44B zu sehen ist. Andererseits wurde festgestellt, dass die Epitopinzidenz zwischen Bet v 1 und Mal d 1 begrenzt sein kann,47 wie eine aktuelle Studie zeigt, in der die Isolierung von humanem IgE beschrieben wurde, das an Bet v 1, aber nicht an Mal d 1 bindet.51 Darüber hinaus enthalten verschiedene Mal d 1-Isoformen Aminosäuresubstitutionen innerhalb potenzieller IgE-Interaktionsflächen,39 was darauf hindeutet, dass sie die immunologische Reaktion beeinflussen können.

Es ist klar, dass hochauflösende Strukturdaten die Grundlage für die Bestimmung und den Vergleich struktureller Details von (kreuzreaktiven) Bindungsepitopen in allergenen Proteinen bilden. Darüber hinaus ist das Pfropfen von Konformationsepitopen durch Übertragung von Restabschnitten zwischen homologen Allergenen zu einem wertvollen experimentellen Werkzeug geworden. Das Epitop-Grafting wurde verwendet, um die Rolle des BV16-Epitops in Mal d 1 zu charakterisieren, indem dieses Epitop auf der Mal d 1-Oberfläche neu erzeugt wurde, wobei seine Bedeutung für die IgE-Bindung und die Kreuzreaktivität mit Bet v 1 bestätigt wurde.39 In einem orthogonalen Ansatz wurden mehrere Mal d 1-Abschnitte, die Residuen umfassen, die für die IgE-Bindung entscheidend sind, auf Bet v 1 übertragen, um die Rolle dieser strukturellen Segmente für die Kreuzreaktivität zu untersuchen,50 und Chimären von Bet v 1 und Mal d 1 wurden erzeugt, um das Epitop eines humanen monoklonalen IgE, das aus einer Phagenbibliothek isoliert wurde, auf den C-Terminus von Bet v 1 abzubilden.51 Darüber hinaus bietet das Epitop-Grafting Zugang zu chimären Allergenen mit fein abgestimmten antigenen Eigenschaften, wie z. B. reduzierten IgE-Bindungskapazitäten, für die molekülbasierte Allergiediagnose und spezifische Immuntherapie.52 Die Kenntnis der strukturellen Details dieser Allergenelemente ist notwendig, um korrekt gefaltete Chimären zu generieren, da der Transfer von (teilweise) nicht übereinstimmenden Abschnitten der Sekundärstruktur zwischen verschiedenen Allergenen der Grund für den Verlust der Proteinfaltung und damit der Reduktion der IgE-Bindungskapazitäten sein kann.41 Die hier vorgestellte dreidimensionale Struktur von Mal d 1.0101 bietet die biophysikalische Grundlage, um die molekularen Details der immunologischen Kreuzreaktivität im Detail aufzuklären.