DISKUSSION

In dieser Studie präsentieren wir SAXS-Lösungsstrukturen für Hb und Hb konjugiert mit zwei oder sechs bis sieben Kopien von 5-kD PEG. Dies ist das erste Beispiel für eine 3D-Strukturbestimmung eines PEG-konjugierten Hämoglobins, wenn auch mit niedriger Auflösung. Die wichtigsten Erkenntnisse aus dieser Studie sind: i), die PEG-Konjugation verursacht keine grobe Verzerrung der Tertiärstruktur von Hb (bei dieser Auflösung), aber seine Quartärstruktur erscheint verdichtet; ii), ein Teil der PEG-Ketten dringt in Hohlräume zwischen den Hb-Untereinheiten ein, ein Teil bleibt in der Nähe der Proteinoberfläche, und der Rest ragt von der Oberfläche weg; iii), die PEGylierung verändert das kugelförmige Hb-Molekül in eine längliche Struktur mit entweder zwei oder sechs konjugierten PEGs; iv), die PEG-Konjugation führt zu einer Abstoßung zwischen den PEGylierten Hb-Molekülen, verursacht durch die PEG-Schicht, die das Protein Hb umgibt, was sich durch einen ausgeprägten Konzentrationseffekt in den SAXS-Daten manifestiert.

Die experimentelle Streuung von Hb wird gut durch die berechnete Kurve aus der Kristallstruktur von oxyHb angepasst, während die Kristallstruktur von deoxyHb eine schlechtere Anpassung liefert. Sowohl P5K2 als auch P5K6 sind an Cys-β93 konjugiert, das an das proximale His-β92 angrenzt, welches der einzige Rest in den β-Untereinheiten von Hb ist, der direkt mit dem Häm-Eisen koordiniert ist. Es scheint wahrscheinlich, dass die Anlagerung eines 5-kD-PEGs lokale, geringfügige strukturelle Verzerrungen der Häm-Tasche der β-Untereinheit verursacht, die bei dieser Auflösung (∼12 Å) nicht nachweisbar sind. Dies wird durch Studien zur Kinetik des Hämverlustes unterstützt, die für die β-Untereinheit von P5K6 im Vergleich zu nicht konjugiertem Hb 5-mal höher ist, während die α-Untereinheiten eine ähnliche Kinetik wie Hb zeigen (8). In Übereinstimmung mit dieser Interpretation zeigten 1H-NMR-Studien eines PEG-konjugierten Hb, das in seiner chemischen Struktur dem hier untersuchten P5K6 ähnlich ist, eine Verschiebung des proximalen Histidins der β-, aber nicht der α-Untereinheiten (28). Darüber hinaus befinden sich Reste in der Nähe von Cys-β93 in einer konformationell plastischen Region, die direkt mit den allosterischen Eigenschaften von Hb verknüpft ist (29,30).

Die Modifikation der Cys-β93-Reste mit N-Ethylmaleimid allein bewirkt einen Verlust an Kooperativität, und dieser Effekt, zusammen mit der Verdichtung der quaternären Struktur, könnte den scheinbaren Verlust an Kooperativität in Hemospan erklären (5). Die quaternäre Bewegung könnte eingeschränkt sein, was zu einem nur teilweisen Übergang zwischen R- und T-Zuständen oder einer intermediären quaternären Struktur führt. Ein solcher Effekt wurde bereits früher in Betracht gezogen, um die Kinetik der O2-Bindung an Hemospan zu interpretieren (7).

Da die Weitwinkelanteile der Streuung von Hb und PEG-Hb zusammenfallen, können signifikante tertiäre/sekundäre Strukturänderungen aufgrund der PEGylierung ausgeschlossen werden, und unsere Ergebnisse deuten somit auf eine kompaktere quaternäre Struktur des PEGylierten Proteins hin. Dies lässt sich durch eine partielle Dehydrierung der Intersubunit-Grenzflächen erklären, die durch die PEG-Ketten verursacht wird, die sich, eher unerwartet, teilweise im Inneren des PEG-Hbs befinden. Die quaternäre Struktur von oxyHb schafft einen zentralen Hohlraum zwischen den vier Untereinheiten des Hämoglobins. Der Hohlraum kann mindestens 80 Wassermoleküle aufnehmen, wie die hochauflösende Kristallstruktur von oxyHb zeigt (27). Dementsprechend reicht das Volumen für PEG aus, um in die Grenzfläche zwischen den Untereinheiten einzudringen und die im Inneren des Tetramers befindlichen Wassermoleküle zu verdrängen. Darüber hinaus ist bekannt, dass PEG eine Dehydratisierung bewirkt und wird häufig als Co-Lösungsmittel für die Proteinkristallisation verwendet. In Verbindung mit der Verdrängung von Wassermolekülen, die sich im zentralen Hohlraum befinden, könnte eine allgemeine Dehydratisierung zu der kompakten quaternären Struktur von PEG-Hbs beitragen. Diese Schlussfolgerung ist konsistent mit molekulardynamischen Simulationen, die eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der PEGylierung und dem PEG-Hb-Molekülvolumen gezeigt haben, mit einer entsprechenden Verdrängung der Wassermoleküle aus der Hb-Struktur (31).

Da sich der größte Teil der PEG-Ketten außerhalb des Hb befindet, stimmen unsere Ergebnisse mit früheren Studien überein, die zeigen, dass PEG durch sterische Ausschlusskräfte bevorzugt von Proteinen ausgeschlossen wird (32). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass PEG in Konkurrenz zu den Ausschlusskräften mit unpolaren Proteinoberflächenresten interagiert (32), und es wurde über die Interaktion von 5-kD-PEG mit hydrophoben Clustern auf der Oberfläche von Cytochrom c berichtet (33). Der Hydrophobizitäts-Score für Hb wurde nach Kyte und Doolittle (34) berechnet (Abb. 6), wobei die Residuenzahlen mit den helikalen Segmenten ausgerichtet wurden. Ein Bereich von besonderem Interesse für mögliche PEG-Hb-Wechselwirkungen liegt über den relativ hydrophoben G-H-Helices an den α1β1-Packungskontakten zwischen Dimeren. Unsere Modelle zeigen Oberflächenwechselwirkungen von PEG mit Hb, obwohl die Auflösung nicht ausreicht, um die beteiligten Hb-Reste oder deren Polarität zu definieren. Die Analyse von SAXS-Spektren, die bei einer relativ hohen Proteinkonzentration aufgezeichnet wurden, zeigt einen deutlichen Konzentrationseffekt sowohl für P5K2 als auch für P5K6, während dieser Effekt bei nicht konjugiertem Hb nahezu nicht vorhanden ist. Wie zu erwarten, ist der Konzentrationseffekt für P5K6 ausgeprägter als für P5K2, was darauf hindeutet, dass die Einführung zusätzlicher PEG-Ketten zu einer besseren Abschirmung des Hb-Moleküls führt, was auch mit Molekulardynamikberechnungen von theoretisch PEG-konjugiertem Hb übereinstimmt (31).

Intuitiv würde man erwarten, dass die PEG-Hbs die gleiche Form haben wie das nicht PEGylierte Hb, aber hier zeigen wir, dass die Form eines PEGylierten Proteins nicht durch die des Kernproteins definiert ist. Die nicht kugelförmige Lösungsform des PEG-Hbs wurde nicht erwartet und liefert neue Informationen zur Berechnung der PEG-Hb-Diffusionskonstanten mit Hilfe der Stokes-Einstein-Gleichung. Wir haben über Simulationen des Sauerstofftransports durch zellfreie Hbs, einschließlich PEG-Hb, berichtet, bei denen sich die molekulare Diffusion von Hb als ein kritischer Faktor für den gesamten Sauerstofftransport erwies (35). Obwohl die Schlussfolgerung gilt, wurde in dieser Studie die vereinfachende Annahme verwendet, dass die Hb-Moleküle kugelförmig sind. Da die SAXS-Lösungsstruktur dieser Annahme widerspricht, können nun korrekte Moleküldimensionen verwendet werden, um genauere Simulationen zu liefern.

Weiterhin, obwohl sowohl P5K2 als auch P5K6 ähnliche Formen und Gesamtabmessungen haben, stellt der Unterschied in der abstoßenden Wirkung der Partikel in Lösung eine höchst kritische Eigenschaft dar, die einige der positiven Effekte von PEGylated Hbs in vivo erklären könnte. Die Allgemeingültigkeit dieser Beobachtungen kann auf die angehängten PEG-Ketten zurückgeführt werden und legt nahe, dass der Konzentrationseffekt eine allgemeine Folge der PEG-Konjugation ist. Dementsprechend kann man in vivo vermuten, dass dieser Effekt nicht nur intermolekulare Wechselwirkungen zwischen benachbarten PEG-konjugierten Proteinen verhindert, sondern auch zwischen konjugierten und nicht-konjugierten Proteinen oder sogar zellulären Strukturen.

Einige allgemeine Vorteile, wie z.B. erhöhte intravaskuläre Retentionszeit, verringerte Immunogenität und verbesserte Löslichkeit, werden häufig mit der Anbringung eines PEG-Polymers an ein Protein in Verbindung gebracht. So wurde beispielsweise durch die Bindung eines 40-kDa-verzweigten PEG-Polymers an Interferon-β-1b dessen zirkulierende Halbwertszeit von 1,1 h für das nicht-konjugierte Protein auf 9,4 h für das PEG-konjugierte Medikament deutlich verbessert; darüber hinaus verringerte die Bindung von PEG die Immunogenität des Proteins und die Tendenz zur Aggregation drastisch (4). Die Fähigkeit von PEG-Hb, andere Proteine oder Zellen innerhalb seines ausgeschlossenen Volumens auszuschließen, ist besonders kritisch für das Design von Sauerstofftherapeutika. Hämoglobin-basierte Produkte werden optimiert, um die Zirkulationszeit zu verlängern und gleichzeitig die Toxizität zu minimieren oder zu eliminieren. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der verlängerten zirkulatorischen Halbwertszeit von Hemospan, die ∼20 h bei fehlender Hämoglobinurie beträgt (14), verglichen mit der sehr schnellen renalen Clearance von unmodifiziertem, zellfreiem Hb (36). Eine Verlängerung der Zirkulationszeit von Hemospan kann dadurch entstehen, dass es nicht an den Makrophagenrezeptor CD163 bindet, einen Hb-Scavenger, der mit zunehmender Größe eine progressiv abnehmende Bindung von polymerisiertem Hb zeigt (37). Studien mit Hemospan in diesem System sind im Gange. Darüber hinaus könnte die Abstoßung von PEG-Hb von anderen Immunzellen entscheidend sein, um Entzündungsreaktionen zu vermeiden. Die vorherrschenden Theorien zur zellfreien Hämoglobin-induzierten Vasokonstriktion sind, dass die Hb-Moleküle in enge Annäherung an das Endothel kommen (38) oder durch das Endothel extravasieren (39), was beides den NO-Abbau effizienter machen würde und somit zu einer Erhöhung des Gefäßtonus und den negativen Nebeneffekten von Bluthochdruck und verminderter Perfusion führen würde (40). Es bleibt an dieser Stelle spekulativ, aber die abstoßende Natur der PEG-Modifikation könnte die Interaktion mit der Oberflächenglykokalyx von Endothelzellen reduzieren; somit bietet der Abstoßungseffekt eine Erklärung für die verringerte Vasoaktivität mit Hemospan (10).

Diese neuen Erkenntnisse aus dieser SAXS-Analyse können nun genutzt werden, um PEG-Hbs für maximale oder optimale Abstoßungseffekte sowie Partikelgröße und PEG-Konformationen zu entwerfen. Die intermolekularen Abstoßungskräfte nehmen mit der Gesamtmasse der konjugierten PEGs bei gleicher Polymerlänge deutlich zu (10 vs. ∼30 kD für P5K2 versus P5K6), ein Effekt, der durch Änderungen der Molekülform und/oder -größe nicht vorhergesagt wurde. Somit müssen die Lösungskonformationen der konjugierten PEGs, die ihre Wechselwirkung mit Hb, anderen PEG-Polymeren und umgebenden Wasserschichten einschließen, eine große Rolle bei der Abstoßungswirkung spielen.

Effektive PEG-Längen werden durch die Flory-Dimension, RF, definiert, die aus der effektiven Länge einer Oxyethylen-Einheit, a = 3 bestimmt wird.5 Å (41), und der Anzahl der Einheiten pro Polymer, N (42-44):

Die relativen Abmessungen von RF und der Abstand zwischen den PEG-Pfropfstellen, DG, auf einer Oberfläche bestimmen die Sekundärstruktur des gepfropften PEG-Polymers: Für DG > RF kann sich das PEG-Polymer auf der gepfropften Oberfläche in sich selbst falten, was eine „Pilz“-Konformation ergibt; für DG < RF werden die PEGs aufgrund sterischer Wechselwirkungen zwischen den PEG-Ketten gestreckt und bilden eine „Bürsten“-Konformation; und bei DG ≈ RF befinden sich die PEGs in einer „Pilz-zu-Bürste“-Übergangsphase (45). Für 5-kD-PEG gilt N = 113 und RF ∼ 60 Å. Da der halbmaximale Umfang DG auf der Hb-Oberfläche von einem Cys-β93 zum anderen auf der symmetrisch gegenüberliegenden Seite von Hb ∼110 Å beträgt, ist DG > RF, was eine pilzförmige Konformation der gepfropften PEG-Polymere in P5K2 ermöglicht. Dies spiegelt sich in den PEG-Merkmalen aus der SAXS-Struktur von P5K2 wider, die insgesamt eine ellipsoide Form mit Dmax = 115 Å zeigen. Die Berechnung des maximalen Durchmessers für P5K2 unter Verwendung der Flory-Dimension für 5-kD-PEG ergibt ein Molekül mit Dmax ∼ 190 Å (d. h., Hb-Durchmesser = 70 Å + PEGs, 2 × 60 Å) und liefert damit eine Abschätzung für die Pilzkonformation der PEG-Ketten auf P5K2, die sich auf ∼60 % ihrer vollen Flory-Dimensionen falten.

Das stärker PEG-koordinierte P5K6-Molekül enthält die beiden spezifischen Anheftungsstellen (Cys-β93) und zusätzlich vier bis fünf weitere PEG-Pfropfstellen. Die SAXS-Lösungsstruktur deutet darauf hin, dass die PEG-Ketten von P5K6 eine stärkere sterische Wechselwirkung haben und eine noch länglichere Form im Vergleich zu P5K2 bilden (Abb. 4). Wenn man die Näherung verwendet, dass die PEG-Ketten gleichmäßig über die Oberfläche von Hb verteilt sind, verringert sich DG auf ∼55 Å und DG ≈ RF, was auf eine verlängerte PEG-Konformation hindeutet, die sich aber immer noch in einem Pilz-zu-Bürsten-Übergang befindet. Unter Verwendung der maximalen Flory-Dimension im Vergleich zur gemessenen Dmax = 130 Å scheinen sich die 5-kD-PEG-Ketten auf P5K6 auf ∼70% ihrer vollen Flory-Dimension zu falten, was mit einer Zunahme der PEG-Verlängerung in P5K6 im Vergleich zu P5K2 durch sterische Zwänge übereinstimmt.

Durch die direkte Bestimmung der Partikelgröße mittels SAXS in Kombination mit der Flory-Analyse haben wir vorhergesagt, dass sich P5K6 in einem Pilz-Bürsten-Übergang befindet und somit nicht seine maximale Partikelgröße erreicht, wenn die konjugierten PEGs vollständig verlängert sind. Neue PEG-Hb-Moleküle können für größere Partikel konstruiert werden, so dass DG < RF entweder durch: 1) ein stärker konjugiertes Hb mit mehr PEG-Anbindungsstellen geschaffen wird, wodurch DG verringert wird, oder 2) die PEG-Länge erhöht wird, wodurch RF erhöht wird. Die Verdoppelung der PEG-Größe auf 10 kD (d. h. P10Kx, wobei x die Anzahl der Konjugationsstellen ist) erhöht RF auf ∼90 Å, was unserer Vorhersage nach eine Pilzkonformation in P10K2 ergibt, sich aber einer volleren Bürstenkonformation in P10K6 annähert. Es ist jedoch nicht bekannt, wie die Verlängerung der PEG-Polymerlängen die sterischen Wechselwirkungen während der chemischen Konjugationsreaktion von PEG-Hb verändert, so dass neue Designs die experimentelle Praxis mit Reaktionsverhältnissen in Verbindung mit SAXS-Studien rechtfertigen, um den Pilz-zu-Bürste-Übergangspunkt zu verifizieren.