Rekombinante DNA (oder rDNA) wird durch die Kombination von DNA aus zwei oder mehr Quellen hergestellt. In der Praxis beinhaltet der Prozess oft die Kombination der DNA verschiedener Organismen. Der Prozess hängt von der Fähigkeit ab, DNA-Moleküle an Stellen zu schneiden und wieder zusammenzufügen, die durch spezifische Sequenzen von Nukleotidbasen, die Restriktionsstellen genannt werden, gekennzeichnet sind. DNA-Fragmente werden mit Hilfe von Restriktionsenzymen (auch Restriktionsendonukleasen genannt) aus ihrer normalen Position im Chromosom herausgeschnitten und dann mit Hilfe von Enzymen, die Ligasen genannt werden, in andere Chromosomen oder DNA-Moleküle eingefügt.

Genklonierung

Dies beschreibt den Prozess des Kopierens von DNA-Fragmenten, die dann für viele verschiedene Zwecke verwendet werden können, wie z. B. die Schaffung von gentechnisch veränderten Nutzpflanzen oder die Suche nach einem Heilmittel für Krankheiten. Es gibt zwei Arten des Genklonens: in vivo, bei dem Restriktionsenzyme und Ligasen unter Verwendung von Vektoren eingesetzt werden und die Fragmente in Wirtszellen geklont werden (wie im Bild oben zu sehen). Die andere Art ist in vitro, bei der mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Kopien von DNA-Fragmenten erstellt werden.

Für die in vivo-Klonierung wird ein DNA-Fragment, das ein einzelnes Gen oder eine Reihe von Genen enthält, in einen Vektor eingefügt, der in einer anderen Wirtszelle amplifiziert werden kann. Ein Vektor ist ein Abschnitt der DNA, der ein anderes DNA-Fragment aufnehmen kann, ohne die Fähigkeit zur Selbstreplikation zu verlieren. Ein Vektor, der ein zusätzliches DNA-Fragment enthält, wird als Hybridvektor bezeichnet. Wenn das DNA-Fragment ein oder mehrere Gene enthält, wird der Prozess als Genklonierung bezeichnet.

Klonierung von DNA in Plasmiden

Autor: Genome Management Information System, Oak Ridge National Laboratory, U.S. Department of Energy Genome Programs http://genomics.energy.gov

Es gibt 4 verschiedene Arten von Vektoren:

• Plasmidvektoren
• Lamda (λ)-Phagenvektoren
• Kosmide
• Expressionsvektoren

Die Wirtszelle kopiert die geklonte DNA mit Hilfe ihrer eigenen Replikationsmechanismen. Als Wirte werden eine Vielzahl von Zelltypen verwendet, darunter Bakterien, Hefezellen und Säugetierzellen.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Quelle: Andy Vierstraete

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

Es handelt sich um eine In-vitro-Methode, bei der viele Kopien eines bestimmten DNA-Abschnitts hergestellt werden, ohne dass Vektoren oder Wirtszellen benötigt werden. Die zu kopierende DNA – die Template-DNA – wird mit Vorwärts- und Rückwärts-Primern, die komplementär zum Ende der Template-DNA sind, Nukleotiden und einer Version der DNA-Polymerase, der sogenannten Taq-Polymerase, gemischt. (Dieses Enzym ist unter hohen Temperaturen stabil und wird aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus gewonnen.) Der Prozess beinhaltet die Wiederholung von drei Schritten:

• Denaturierung, die die beiden Nukleotidstränge des DNA-Moleküls trennt
• Primer-Annealing, bei dem die Primer an die einzelsträngige DNA binden
• Extension, bei der Nukleotide an die Primer angehängt werden – in 5′- zu 3′-Richtung – um eine doppelsträngige Kopie der Ziel-DNA zu bilden.

Jeder Zyklus dauert nur wenige Minuten, und wiederholte Zyklen können große Mengen einer bestimmten DNA-Sequenz in wenigen Stunden statt in Tagen produzieren. Allerdings erfordert diese Klonierungsmethode die Kenntnis einiger Details über die zu kopierende Nukleotidsequenz, und die Technik ist sehr empfindlich gegenüber kleinen Mengen von Verunreinigungen.

Genbibliotheken

Quelle: http://www.emunix.emich.edu/~rwinning/genetics/index.htm

Eine Genbibliothek ist eine große Sammlung von klonierten DNA-Sequenzen aus einem Genom. Eine Genom-Bibliothek würde (wie oben zu sehen) theoretisch mindestens eine Kopie jeder Sequenz im Genom eines Organismus enthalten. Diese werden verwendet, um die Struktur eines bestimmten Chromosoms zu untersuchen oder um bestimmte Gene zu klonen. Diese Arten von Bibliotheken können aus einer Teilmenge des gesamten Genoms (z. B. einem einzelnen Chromosom) hergestellt werden. Der erste Schritt bei der Erstellung einer Genombibliothek besteht darin, das Genom mit physikalischen Methoden oder Restriktionsenzymen aufzubrechen oder zu „fraktionieren“. Die Fragmente werden dann an geeignete Vektoren gebunden und in eine geeignete Wirtszellpopulation kloniert.

Eine cDNA-Bibliothek (komplementäre DNA) enthält die in einer bestimmten Zellpopulation vorhandene DNA, die mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase aus der mRNA (Boten-RNA) hergestellt wird. Die resultierende cDNA repräsentiert die in der Zellpopulation exprimierten Gene als Teilmenge des gesamten Genoms und kann mit Hilfe eines Vektors und einer geeigneten Wirtszelle kloniert werden (wie in der Abbildung oben zu sehen). Die cDNA enthält keine Introns oder regulatorischen Sequenzen, da diese während der Prozessierung aus der RNA entfernt werden, was die Pflege einer cDNA-Bibliothek erleichtert. Eine cDNA-Bibliothek kann auch mittels Reverse-Transkriptase-PCR hergestellt werden.

Die Identifizierung von Genprodukten in einer Genbibliothek

Restriktionsenzyme (zum Schneiden der DNA) und Gelelektrophorese (zum Trennen der resultierenden Fragmente) können verwendet werden, um eine physikalische Karte der DNA-Segmente in einem Prozess zu erstellen, der als Restriktionsmapping bekannt ist. Ein Beispiel dafür, wie so etwas aussehen kann, sehen Sie unten.

Quelle: University of Leicester

Es gibt auch eine Reihe von Techniken, die verwendet werden können, um spezifische Gene oder Genprodukte innerhalb einer Genbibliothek zu identifizieren, und diese sind: Southern Blotting, Northern Blotting und Western Blotting. Die leistungsfähigste experimentelle Technik zur Untersuchung der Genetik auf molekularer Ebene ist jedoch die DNA-Sequenzierung, mit der die Nukleotidsequenzen von Genen – sogar ganzer Chromosomen – bestimmt werden können. Automatisierte Sequenziertechnologien ermöglichen es uns heute, die gesamten Genome von Organismen, von Bakterien bis hin zum Menschen, zu sequenzieren.

Molekulare Genetik und Biotechnologie

Die neuen Techniken der Molekulargenetik, kombiniert mit Entwicklungen in den dazugehörigen Biotechnologien, haben zu Fortschritten in einer Reihe von verschiedenen Bereichen geführt. Wir können jetzt die Genome von Arten analysieren, die einen wichtigen Beitrag zur Landwirtschaft, zur Kraftstoffproduktion oder zur Medikamentenentwicklung leisten. Wir können bestimmte Gene von einem Organismus in einen anderen verschieben, um transgene Pflanzen und Tiere zu schaffen, und wir können die Klonierung von Tieren nutzen, um Tiere zu erzeugen, die genetisch identisch sind, wie z. B. Dolly das Schaf, und in jüngerer Zeit geklonte Haustiere wie Katzen und Hunde.

Der Prozess des Klonens ist einfach, aber die Ergebnisse sind nicht immer vorhersehbar. Es brauchte viele hundert Versuche, bis es funktionierte und ein einziges lebendes Schaf produziert wurde, und das Klonen an sich wirft nicht nur viele Fragen über Nutzen und Risiken auf, sondern auch viele ethische Fragen.

Die Grafik eines Schweins zeigt, wie das Klonen von Tieren durchgeführt wird. Quelle: National Human Genome Research Institute

Die Technik des genetischen Fingerabdrucks, die die Identifizierung von Individuen und die Beziehungen zwischen Individuen ermöglicht, hat heute viele Anwendungen in der Wissenschaft gefunden. Es gibt auch laufende Forschungen zur Gentherapie, die die Möglichkeit untersucht, geklonte Gene einzuführen, um defekte, mutierte Gene zu kompensieren. Und andere Bereiche, wie z.B. das Klonen von Menschen und die Stammzellenforschung, werfen viele ethische Fragen auf, die neben den wissenschaftlichen Entwicklungen angegangen werden müssen.

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