DNA Typing: Minisatélites e Repetições Curtas Tandem
DNA datilografagem proporcionou vantagens evidentes sobre a análise tradicional de proteínas, principalmente porque é mais informativo e pode ser analisado em material minúsculo ou degradado uma vez que o ADN é fisicamente muito mais resistente à degradação do que as proteínas. Além disso, o mesmo genótipo de ADN pode ser obtido a partir de qualquer tecido (i.e, sangue, saliva, sémen, cabelo, pele e ossos), enquanto que a análise de marcadores de proteínas é restrita às células onde estas proteínas são expressas.
Os mini-satélites foram inicialmente detectados através da hibridação de sondas para o DNA genómico digerido por restrição enzimática, e partilharam ‘sequências centrais’ entre diferentes minissatélites loci permitiram a aplicação de sondas para detectar muitos mini-satélites independentes em simultâneo, produzindo os padrões hipervariáveis multibandas conhecidos como impressões digitais de DNA.
Originalmente, foram propostas sondas multibandas para análise genética forense. No entanto, estes tipos de sondas não tiveram muito sucesso no campo forense, porque embora altamente informativos, surgiram problemas estatísticos de avaliação das provas em casos de correspondência e padronização de bandas. Por estas razões, as sondas multilocus foram substituídas no campo forense pela utilização de minissatélites clonados específicos, ‘single locus probes’ (SLPs), onde cada uma revelou apenas um único polimorfismo de fragmento de fragmento de restrição de comprimento altamente polimórfico, simplificando assim a interpretação. Tipicamente, foram utilizados quatro SLPs sucessivamente para sondar uma mancha sul, produzindo oito fragmentos hipervariáveis por indivíduo.
Foi com os SLPs que se realizou a primeira investigação criminal baseada em ADN; este caso culminou na condenação de Colin Pitchfork por dupla violação e homicídio em Leicestershire em 1986. Muito rapidamente, a análise de ADN tornou-se o método padrão em genética forense, uma vez que foi utilizado pela maioria dos laboratórios em toda a gama de aplicações, especialmente em casos forenses criminais (análise de manchas e pêlos) e identificação.
Até à introdução da análise de repetição em tandem curta (STR) por amplificação da reacção em cadeia da polimerase (PCR), a análise de mini-satélites com SLP era muito popular nos laboratórios forenses.
A principal vantagem da análise de SLP é a enorme variabilidade de alguns dos mini-satélites loci e o conhecimento bem documentado da taxa de mutação em alguns deles. As principais desvantagens são o tempo necessário para a análise e a necessidade de quantidades relativamente grandes de ADN não degradado necessárias para uma tipagem bem sucedida de SLP. Uma vez que o ADN extraído de amostras forenses é frequentemente degradado devido a condições ambientais, as técnicas de SLP falharam frequentemente em produzir resultados fiáveis. A PCR superou estas dificuldades e aumentou fortemente a utilidade das técnicas de caracterização do ADN na ciência forense.
O método PCR foi concebido e nomeado por Mullis e colegas da Cetus Corporation em 1987, embora o princípio tivesse sido descrito em pormenor por Khorana et al. mais de uma década antes; contudo, a utilização da PCR foi limitada até que as polimerases de ADN termo-estáveis adequadas se tornassem disponíveis a partir de bactérias termofílicas.
Os sistemas de tipagem de ADN baseados na PCR permitem que os alelos sejam identificados como entidades discretas, tornando assim mais fácil a padronização ao evitar a maioria das questões estatísticas que surgem na correspondência e no encadeamento de bandas SLP que ocupam um continuum. Além disso, para além do aumento da sensibilidade inerente a qualquer técnica de PCR, é mais provável que seja bem sucedida na análise de material antigo ou muito degradado, principalmente devido ao menor tamanho de muitos dos polimorfismos de ADN (SNPs e STRs), tornando-os mais receptivos à análise por PCR.
O primeiro grupo de marcadores utilizados após amplificação por PCR foram os genes HLA classe II, especialmente o sistema HLA DQA1 analisado com o uso de sondas de oligonucleótidos específicos da sequência. Quase imediatamente após ter sido demonstrado que era viável analisar marcadores de ADN por tecnologia PCR, os kits tornaram-se comercialmente disponíveis para vários loci genéticos. O kit de amplificação de PCR AmpliType PolyMarker (Perkin-Elmer, Foster City, CA, EUA) era muito popular nos laboratórios forenses da época. Com este kit, os loci HLA DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, e GC são amplificados de uma forma multiplexada. Os últimos cinco loci listados foram datilografados simultaneamente numa única tira de ponto invertido contendo sondas ASO; HLA DQA1 foi datilografado numa tira separada.
Os esforços dos cientistas forenses foram então dirigidos à amplificação de polimorfismos de comprimento de fragmentos. O minisatélite D1S80 (pMCT118) foi o primeiro a ser aplicado à análise forense, mas todos estes primeiros sistemas de PCR foram substituídos por STRs (alternativamente denominados microsatélites). A análise de STR por PCR é agora o método de escolha para a identificação forense baseada no ADN.
STRs foram descobertos em 1989 e foram aplicados a casos forenses no início dos anos 90. As vantagens da utilização de STRs de repetição tetra e pentanucelotídica (unidades de repetição de 4 e 5 bases) sobre os di- e trinucleótidos (repetições de 2 e 3 bases) rapidamente se tornaram evidentes e iniciou-se uma pesquisa sistemática das STRs mais convenientes. Seguiu-se o processo de padronização de técnicas e nomenclatura realizado por organismos como SWGDAM nos Estados Unidos e EDNAP na Europa e o papel activo da Comissão de ADN da ISFG.
Outro passo importante foi a possibilidade de amplificar múltiplos STR loci numa única reacção de PCR multiplex combinada. Quando esta abordagem de PCR foi associada à detecção directa de produtos amplificados em géis de poliacrilamida, o perfil de ADN STR tornou-se passível de automatização. Os multiplexes comerciais STR para sistemas electroforéticos manuais estavam disponíveis a partir de 1993. Os géis de poliacrilamida desnaturantes foram utilizados para a separação de fragmentos de ADN até à introdução da electroforese capilar que, juntamente com a introdução da tecnologia de iniciadores à base de corantes fluorescentes e a utilização de sequenciadores de ADN, revolucionaram o campo, permitindo a tipagem de grandes multiplexes STR. Vários multiplexes comerciais marcados com corantes tornaram-se entretanto disponíveis e todos incluem uma gama de STRs mais amelogenina para determinação do sexo. Os multiplexes actualmente utilizados combinam 15 STR ou mais. O poder de discriminação combinado dos multiplexes STR é muito elevado e as probabilidades de dois indivíduos não relacionados corresponderem por acaso (probabilidade de correspondência aleatória – RMP) são inferiores a 10-15 para a maioria dos maiores multiplexes STR.
Desde meados dos anos 90, as bases de dados informáticas contendo perfis STR de amostras de locais de crime, criminosos condenados, e, em alguns casos, pessoas presas mas posteriormente ilibadas de um crime, proporcionaram às agências de aplicação da lei a capacidade de ligar os criminosos aos perfis STR do local do crime. A aplicação desta tecnologia permitiu a resolução de milhares de crimes em todo o mundo.
Finalmente, o redesenho de primários de PCR, que estavam mais próximos da região de repetição de STR, permitiu em 2001 a criação de ‘miniSTRs’ com potencial para melhorar a análise de material biológico degradado.