RESULTA E DISCUSSÃO

Para clonar o gene da miostatina de outras espécies, as bibliotecas de cDNA foram construídas a partir de RNA isolado do tecido muscular esquelético e rastreado com uma sonda de miostatina do rato correspondente à região conservada do terminal C, que é a porção madura e activa da molécula. Um alinhamento das sequências previstas de aminoácidos de murino, rato, humano, babuíno, bovino, suíno, ovino, galinha, peru, e miostática de zebrafish, deduzido da análise da sequência de nucleótidos de clones de cDNA a todo o comprimento, é mostrado na Fig. 1. Todas estas sequências contêm uma putativa sequência de sinal para secreção e um putativo local de processamento proteolítico RXXR (aminoácidos 263-266) seguido por uma região contendo os resíduos conservados de cisteína C-terminal encontrados em todos os factores de crescimento transformadores β membros da família (1). Como se pode ver a partir deste alinhamento, a miostatina é altamente conservada em todas as espécies. De facto, as sequências de murino, rato, humano, suíno, galinha e miostatina de peru são 100% idênticas na região C-terminal após o suposto local de processamento proteolítico, e a miostatina de babuíno, bovino e ovino contém apenas uma a três diferenças de aminoácidos na proteína madura. A miostatina Zebrafish é consideravelmente mais divergente e é apenas 88% idêntica às outras nesta região.

O elevado grau de conservação da miostática em sequência entre espécies sugere que a função da miostática também foi conservada. Para determinar se a miostatina desempenha um papel na regulação da massa muscular em animais que não ratos, investigámos a possibilidade de que mutações no gene da miostatina possam ser responsáveis pelo aumento da massa muscular observada em raças de gado com musculatura dupla. A dupla musculatura, que tem sido observada em muitas raças de gado nos últimos 190 anos, parece ser herdada como um único grande locus autossómico com vários modificadores de expressão fenotípica, resultando numa penetração incompleta (7). Na raça bovina de duplo musculado mais estudada, Belgian Blue, o fenótipo de duplo musculado (Fig. 2) segrega como um único locus genético designado por hipertrofia muscular (mh) (8). A mutação mh, que é parcialmente recessiva, causa um aumento médio da massa muscular de 20-25%, uma diminuição da massa da maioria dos outros órgãos (9, 10), e uma diminuição da gordura intramuscular e do tecido conjuntivo (11). O mh locus está estreitamente ligado a marcadores numa região do cromossoma bovino 2 (12) que é sinténico a uma região do cromossoma humano 2 (2q32) (13) à qual tínhamos mapeado o gene da miostatina humana por hibridação in situ fluorescente (dados não mostrados).

As semelhanças no fenótipo entre o ratos myostatin nulo e a raça bovina azul belga e as posições semelhantes no mapa do gene myostatin e o mh locus sugeriram o homólogo bovino da myostatin como um gene candidato para o mh locus. Para determinar se o gene da miostatina bovina está mutado na raça Azul Belga, os três exões do gene do touro Azul Belga de sangue inteiro mostrado na figura 2 foram amplificados por PCR, subclonados, e sequenciados. A sequência de codificação da miostática azul belga foi idêntica à sequência de Holstein, excepto para uma eliminação dos nucleótidos 937-947 no terceiro exão (Fig. 3). Esta eliminação dos 11-nucleótidos provoca uma mudança de moldura que se prevê resultar numa proteína truncada que termina 14 códones a jusante do local da mutação. Espera-se que a eliminação seja uma mutação nula porque ocorre apenas após os primeiros 7 aminoácidos da região terminal C, resultando numa perda de 102 aminoácidos (aminoácidos 274-375). Esta mutação é semelhante à mutação visada em ratos myostatin null, em que toda a região que codifica a proteína madura foi eliminada (2). Pela análise da mancha sul, utilizando oligonucleótidos correspondentes à sequência de tipo selvagem ou mutante, esta mutação foi encontrada em ambos os alelos em 14/14 gado azul belga de sangue total examinado (dados não mostrados).

Também sequenciamos o gene da miostatina noutra raça bovina, Piemonte, na qual a dupla musculatura ocorre a uma frequência extremamente elevada (4). A sequência piemontesa continha 2 alterações nucleotídicas em relação à sequência Holstein. Uma era uma transversa de C a A no exon 1, resultando numa substituição conservadora da leucina por fenilalanina (aminoácido 94). A segunda foi uma transição de G para A no exon 3, resultando numa substituição de cisteína por tirosina na região madura da proteína (aminoácido 313) (Fig. 3). Através da análise da mancha sul, esta mutação foi encontrada em ambos os alelos em 10/10 bovinos piemonteses com manuscrito duplo examinados. Esta mutação é susceptível de resultar numa perda completa ou quase completa da função, uma vez que este resíduo de cisteína é invariável não só entre todas as sequências de miostatina, mas também entre todos os membros conhecidos do factor de crescimento transformador β superfamília (1). Este resíduo de cisteína é conhecido por ser um dos aminoácidos envolvidos na formação da estrutura intramolecular do nó cistina nos membros desta superfamília, pela qual a estrutura tridimensional é conhecida (14-17). Além disso, quando a cisteína correspondente na activina A (cysteine-44) foi transformada em alanina, a proteína mutante tinha apenas 2% de ligação do receptor do tipo selvagem e actividade biológica (18).

As posições cartográficas semelhantes do gene myostatin e do mh locus e a identificação de mutações relativamente graves no gene myostatin de duas raças diferentes de gado bovino de dupla musculatura sugerem que estas mutações são responsáveis pelo fenótipo de dupla musculatura. Para apoiar ainda mais esta hipótese, analisámos o ADN isolado de 120 bovinos individuais de sangue puro ou de raça pura em 16 outras raças que não são classificadas como duplamente musculadas (11 Angus, 11 Charolais, 10 Holstein, 10 Brown Swiss, 10 Polled Hereford, 10 Gelbvieh, 9 Simmental, 9 Jersey, 9 Guernsey, 9 Ayrshire, 7 Limousin, 4 Brahman, 4 Polled Shorthorn, 4 Red Angus, 2 Chianina, e 1 Texas Longhorn) para a presença de cada uma destas mutações (Fig. 4). Pela análise da mancha sul, a substituição da cisteína pela tirosina presente na raça piemontesa não foi detectada em nenhum dos 120 indivíduos. A eliminação de 11-nucleótidos presentes na raça azul belga foi detectada num alelo de um único touro de sangue completo de Angus Vermelho sem duplos músculos. A este respeito, foi sugerido que o fenótipo de dupla musculatura que ocasionalmente se observa em muitas raças pode ser devido a uma única mutação ou muito poucas mutações que migraram para muitas das raças europeias de gado durante o desenvolvimento das raças modernas (7). Os nossos resultados demonstram que as mutações miostatinas que provocam a dupla mustação ocorreram pelo menos duas vezes no gado.

p>Finalmente, para excluir a presença de outras mutações de miostáticos em raças não duplamente musculadas, determinámos a sequência completa da região de codificação de miostáticos de 11 destas raças (Angus, Charolais, Brown Swiss, Polled Hereford, Gelbvieh, Guernsey, Ayrshire, Limousin, Brahman, Polled Shorthorn, e Texas Longhorn). Esta análise revelou apenas polimorfismos que ou eram alterações silenciosas nas sequências de codificação ou estavam presentes nos introns e regiões não traduzidas.

Não semelhantes em ratos, uma mutação nula da miostatina no gado causa uma redução no tamanho dos órgãos internos e apenas um modesto aumento na massa muscular (20-25% na raça Azul Belga em comparação com 200-300% em ratos com deficiência em miostatina). É possível que o gado possa estar mais próximo de um limite máximo de tamanho muscular após gerações de reprodução selectiva para grande massa muscular, ao contrário dos ratos, que não foram seleccionados de forma semelhante. A este respeito, mesmo nas raças bovinas que não são fortemente musculadas, a sequência miostatina contém duas diferenças adjacentes de aminoácidos não conservadores (EG vs KE) na região terminal C, em comparação com todas as outras espécies examinadas. Embora o significado funcional destas diferenças seja desconhecido, é possível que estas duas alterações representem um alelo de perda parcial da função que se fixou na população durante muitos anos de criação de gado.

Para aplicações agrícolas, existem algumas desvantagens para o gado com dupla musculatura, nomeadamente a redução da fertilidade feminina, menor viabilidade da descendência, e atraso na maturação sexual (19). No entanto, na raça azul belga, o aumento da massa muscular e a maior eficiência alimentar compensam largamente estes inconvenientes (20). O facto de uma mutação nula no gene da miostatina no gado bovino resultar em animais que ainda são viáveis e férteis e produzem carne de alta qualidade demonstra o valor potencial de produzir um aumento da massa muscular noutros animais de carne, tais como ovelhas, porcos, galinhas, perus e peixes, perturbando a função da miostatina. De facto, o elevado grau de conservação da sequência em animais, desde mamíferos a aves e peixes, sugere que a função biológica da miostatina tem sido amplamente conservada em todo o reino animal.