Profase tardia, ou prometafase, começa com a ruptura do envelope nuclear, que se decompõe em pequenas vesículas de membrana que se assemelham muito ao retículo endoplasmático e tendem a permanecer visíveis em torno do fuso mitótico. Durante este período, os cromossomas continuam a condensar e gradualmente encurtam e engrossam até formarem completamente as unidades que irão sofrer a mitose. O nucléolo, que ainda pode estar presente em algumas células, também desaparece completamente na prometafase.

Apresentada na imagem de microscopia de fluorescência digital acima é um único canguru de rato (PtK2) célula renal nas fases iniciais da prometafase. A cromatina é corada com uma sonda fluorescente azul (DAPI), enquanto a rede de microtubos (fuso mitótico) é corada de verde (Alexa Fluor 488) e as mitocôndrias celulares são coradas com um corante vermelho (MitoTracker Red CMXRos). Durante a prometafase, os microtubos do fuso mitótico estão agora livres para entrar na região nuclear, e a formação de complexos proteicos especializados conhecidos como cinectócitos começa em cada centromero. Estes complexos tornam-se ligados a um subconjunto dos microtubos do fuso, que são então denominados microtubos cintócicos. Outros microtubos no fuso (não ligados a centrómeros) são denominados microtubos polares, e estes ajudam a formar e manter a estrutura do fuso juntamente com os microtubos astrais, que permanecem fora do fuso.

O limite entre a prófase e a prometafase é determinado pelo rápido início da fosforilação em toda a lâmina nuclear desencadeado pela activação de uma enzima denominada mitose -cinase proteica indutora de cinase (MPF abreviada). O complexo de membrana nuclear é desagregado em vesículas como resultado, expondo os cromossomas condensados à rede microtubular em expansão do fuso mitótico. No microscópio óptico, as vesículas de membrana nuclear, que são praticamente indistinguíveis de porções desagregadas semelhantes do retículo endoplasmático, podem ser visualizadas na região em torno do fuso em crescimento.

As microtubulos de cinetócitos fixam-se aos seus receptores nos cinetócitos cromatídeos, os cromossomas são colocados em movimento agitado e movem-se rapidamente para trás e para a frente à medida que a tensão é exercida pelo fuso. Simultaneamente, os microtubulos polares que emanam dos centrosomas interagem entre si para formar uma rede de interligação entre os cromossomas e estabelecer ainda mais a estrutura do fuso mitótico. Os cinetogramas são montados no centromero de cada cromatídeo para produzir dois cinetogramas por cromossoma. Eventualmente, na anáfase, os microtubos cinetócitos puxarão os cromatídeos irmãos para pólos opostos do fuso mitótico para assegurar que cada célula filha receba um complemento genético completo de cromossomas.

A complexidade da relação entre cinetócitos e o fuso mitótico reflecte a exigência de uma distribuição precisa do material genético entre as células que dividem. O erro mais comum na mitose é a falta de separação entre cromatídeos irmãos, resultando em que uma das duas células filhas receba ambas as cópias cromossómicas. Este erro, que ocorre aproximadamente uma vez em 100.000 divisões de células, pode ocorrer se os cromatídeos não se ligarem ao pólo do fuso correcto ou se um par de cromatídeos se ligar a apenas um pólo. Em alguns casos, os dois cromatídeos irmãos, embora correctamente montados no aparelho do fuso mitótico, simplesmente não se separam na anáfase.