Typage d’ADN : Minisatellites et répétitions en tandem courtes

Le typage ADN présentait des avantages évidents par rapport à l’analyse traditionnelle des protéines, principalement parce qu’il est plus informatif et qu’il peut être analysé dans du matériel minuscule ou dégradé, l’ADN étant physiquement beaucoup plus résistant à la dégradation que les protéines. En outre, le même génotype d’ADN peut être obtenu à partir de n’importe quel tissu (par ex, sang, salive, sperme, cheveux, peau et os), alors que l’analyse des marqueurs protéiques est limitée aux cellules où ces protéines sont exprimées.

Les minisatellites ont été initialement détectés par hybridation de sondes sur des buvards de Southern d’ADN génomique digéré par des enzymes de restriction, et les  » séquences centrales  » partagées entre différents loci minisatellites ont permis d’appliquer des sondes pour détecter simultanément de nombreux minisatellites indépendants, ce qui a donné les motifs multibandes hypervariables connus sous le nom d’empreintes génétiques.

À l’origine, les sondes multilocus ont été proposées pour l’analyse génétique médico-légale. Cependant, ces types de sondes n’ont pas eu beaucoup de succès dans le domaine médico-légal, car bien que très informatives, des problèmes statistiques d’évaluation des preuves en cas de correspondance de bandes et de normalisation se sont posés. Pour ces raisons, les sondes multilocus ont été remplacées dans le domaine médico-légal par l’utilisation de minisatellites clonés spécifiques, les « sondes à locus unique » (SLP), dont chacune ne révèle qu’un seul polymorphisme de longueur de fragment de restriction hautement polymorphe, ce qui simplifie l’interprétation. En général, quatre SLP étaient utilisés successivement pour sonder une tache de Southern, ce qui donnait huit fragments hypervariables par individu.

C’est avec les SLP que la première enquête criminelle basée sur l’ADN a été menée ; cette affaire a abouti à la condamnation de Colin Pitchfork pour un double viol et un homicide dans le Leicestershire en 1986. Très vite, l’analyse d’ADN est devenue la méthode standard de la génétique médico-légale puisqu’elle a été utilisée par la majorité des laboratoires dans toute la gamme des applications, en particulier dans les affaires de criminalistique (analyse de taches et de poils) et d’identification.

Jusqu’à l’introduction de l’analyse des répétitions en tandem courtes (STR) par amplification en chaîne par polymérase (PCR), l’analyse des minisatellites avec les SLP était très populaire dans les laboratoires médico-légaux.

Le principal avantage de l’analyse SLP est l’énorme variabilité de certains loci minisatellites et la connaissance bien documentée du taux de mutation dans certains d’entre eux. Les principaux inconvénients sont le temps nécessaire à l’analyse et la nécessité de disposer de quantités relativement importantes d’ADN non dégradé requises pour un typage SLP réussi. Étant donné que l’ADN extrait des spécimens médico-légaux est souvent dégradé en raison des conditions environnementales, les techniques SLP ont souvent échoué à produire des résultats fiables. La PCR a permis de surmonter ces difficultés et elle a fortement amélioré l’utilité des techniques de profilage de l’ADN en criminalistique.

La méthode PCR a été conçue et nommée par Mullis et ses collègues de la Cetus Corporation en 1987, bien que le principe ait été décrit en détail par Khorana et al. plus d’une décennie auparavant ; cependant, l’utilisation de la PCR a été limitée jusqu’à ce que des ADN polymérases thermostables appropriées soient disponibles à partir de bactéries thermophiles.

La plupart des systèmes de typage ADN basés sur la PCR permettent d’identifier les allèles en tant qu’entités distinctes, ce qui facilite la normalisation en évitant la plupart des problèmes statistiques qui se posent lors de la mise en correspondance et du classement des bandes SLP qui occupent un continuum. En outre, outre la sensibilité accrue inhérente à toute technique de PCR, elle a plus de chances de réussir à analyser du matériel ancien ou très dégradé principalement en raison de la taille plus petite de nombreux polymorphismes de l’ADN (SNP et STR), ce qui les rend plus faciles à analyser par PCR.

Le premier groupe de marqueurs utilisé après amplification par PCR était les gènes HLA de classe II, en particulier le système HLA DQA1 analysé à l’aide de sondes oligonucléotidiques spécifiques de la séquence. Presque immédiatement après qu’il a été démontré que l’analyse des marqueurs d’ADN par la technologie PCR était possible, des kits ont été commercialisés pour plusieurs loci génétiques. Le kit d’amplification PCR AmpliType PolyMarker (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) était très populaire dans les laboratoires médico-légaux à cette époque. Avec ce kit, les loci HLA DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 et GC sont amplifiés de manière multiplex. Les cinq derniers loci cités ont été typés simultanément dans une seule bande de dot-blot inverse contenant des sondes ASO ; le HQA1 a été typé dans une bande séparée.

Les efforts des médecins légistes ont ensuite porté sur l’amplification des polymorphismes de longueur de fragment. Le minisatellite D1S80 (pMCT118) a été le premier à être appliqué à l’analyse médico-légale mais tous ces premiers systèmes PCR ont été supplantés par les STR (alternativement appelés microsatellites). L’analyse des STR par PCR est désormais la méthode de choix pour l’identification médico-légale basée sur l’ADN.

Les STR ont été découverts en 1989 et ont été appliqués aux affaires médico-légales au début des années 1990. Les avantages de l’utilisation des STR à répétition tétra- et pentanucelotide (unités de répétition de 4 et 5 bases) par rapport aux di- et trinucléotides (répétitions de 2 et 3 bases) sont rapidement apparus et une recherche systématique des STR les plus pratiques a commencé. S’en est suivi le processus de normalisation des techniques et de la nomenclature accompli par des organismes tels que le SWGDAM aux États-Unis et l’EDNAP en Europe plus le rôle actif de la Commission ADN de l’ISFG.

Une autre étape importante a été la possibilité d’amplifier plusieurs loci STR dans une seule réaction PCR multiplex combinée. Lorsque cette approche PCR a été couplée à la détection directe des produits amplifiés dans des gels de polyacrylamide, le profilage de l’ADN STR est devenu accessible à l’automatisation. Les multiplex STR commerciaux pour les systèmes électrophorétiques manuels étaient disponibles à partir de 1993. Les gels de polyacrylamide dénaturants étaient utilisés pour la séparation des fragments d’ADN jusqu’à l’introduction de l’électrophorèse capillaire qui, avec l’introduction de la technologie des amorces marquées par un colorant fluorescent et l’utilisation de séquenceurs d’ADN, a révolutionné le domaine, permettant le typage de grands multiplexes STR. Plusieurs multiplex commerciaux marqués par un colorant sont depuis lors disponibles et tous comprennent une gamme de STR plus l’amélogénine pour la détermination du sexe. Les multiplex actuellement utilisés combinent 15 STR ou plus. Le pouvoir de discrimination combiné des STR est très élevé et les probabilités que deux individus non apparentés s’apparient par hasard (probabilité de concordance aléatoire – RMP) sont inférieures à 10-15 pour la plupart des plus grands multiplex STR.

Depuis le milieu des années 1990, les bases de données informatiques contenant des profils STR provenant d’échantillons prélevés sur des scènes de crime, de délinquants condamnés et, dans certains cas, de personnes arrêtées mais innocentées par la suite ont permis aux services de police de relier les délinquants aux profils STR prélevés sur des scènes de crime. L’application de cette technologie a permis d’élucider des milliers de crimes dans le monde entier.

Enfin, la nouvelle conception des amorces PCR, plus proches de la région de répétition des STR, a permis en 2001 la création de  » miniSTR  » avec un potentiel d’amélioration de l’analyse du matériel biologique dégradé.

L’analyse de l’ADN et de l’ADN est un élément essentiel de l’analyse de l’ADN.