L’ADN cellulaire est constamment oxydé par divers agents endogènes et exogènes, et les dommages à l’ADN qui en résultent peuvent augmenter le risque de développer un cancer et d’autres maladies . La guanine a le potentiel redox le plus faible des quatre bases de l’ADN et est donc la plus facilement oxydée.
Lors de la réplication de l’ADN, l’incorporation d’adénine en face d’un produit d’oxydation de la guanine induit une transversion G:C-T:A, tandis que l’incorporation de guanine en face d’un produit d’oxydation de la guanine provoque une transversion G:C-C:G. Ces mutations (voir les références dans ) se retrouvent dans de nombreux gènes importants, et en particulier sur les sites CpG du gène suppresseur de tumeur p53 et dans les codons 12 et 13 de l’oncogène K-ras . Il est donc important d’analyser l’incorporation des nucléotides et l’extension de l’ADN pour chaque produit d’oxydation de la guanine afin d’élucider les mécanismes qui sous-tendent la génération des transversions G:C-T:A et G:C-C:G.
La 8-Oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) (figure 1) est l’une des lésions oxydatives de l’ADN les plus courantes et se forme dans diverses conditions oxydatives. La 8-oxoG a fait l’objet d’études approfondies, a un impact biologique important et est un marqueur ubiquitaire de l’ADN endommagé par l’oxydation. Les analyses structurelles ont révélé que la 8-oxoG adopte une conformation anti ou syn : la 8-oxoG dans la conformation anti forme des paires de bases Watson-Crick avec la cytosine, tandis que la lésion dans la conformation syn utilise le bord de Hoogsteen de la lésion pour former une paire de bases avec l’adénine (Fig. 2). En outre, les ADN polymérases incorporent l’adénine en plus de la cytosine en face de 8-oxoG , et 8-oxoG induit une transversion G:C-T:A dans Escherichia coli (E. coli) et les cellules de mammifères .
Produits d’oxydation de la guanine
Les structures de (a) 8-oxoG (anti):C (anti) et (b) 8-oxoG (syn) :A (anti)
Bien que la 8-oxoG provoque des transversions G:C-T:A, le mécanisme qui sous-tend la génération des transversions G:C-C:G ne peut être expliqué par la 8-oxoG. En outre, la 8-oxoG est plus facilement oxydée que la guanine en raison de son potentiel d’oxydation plus faible, et diverses lésions oxydatives sont donc produites par l’oxydation de la 8-oxoG. Par conséquent, il est nécessaire d’étudier à la fois la 8-oxoG et les autres lésions oxydées de la guanine afin de comprendre les différents phénomènes causés par l’oxydation de la guanine.
Les produits d’oxydation de la guanine causant des transversions G:C-C:G forment des paires de bases par liaison hydrogène avec la guanine
Comme mentionné précédemment, la transversion G:C-C:G est causée par l’incorporation de la guanine en face d’un produit d’oxydation de la guanine. Dans cette section, nous décrivons d’abord la « règle A ». L’adénine est la base la plus fréquemment incorporée en face d’un site abasique par les ADN polymérases, ce qui suggère que, parmi les quatre bases naturelles, l’adénine forme le plus d’interactions hydrophobes et présente la meilleure compatibilité spatiale avec un site abasique. L’incorporation de l’adénine ne nécessite pas nécessairement la formation de liaisons hydrogène avec divers sites endommagés de l’ADN matrice. En revanche, l’insertion préférentielle de la guanine nécessite la formation de liaisons hydrogène, en plus des interactions hydrophobes et de la compatibilité spatiale, avec la base matrice. Ainsi, afin de révéler les lésions causant les transersions G:C-C:G, il est important d’étudier les produits d’oxydation de la guanine qui forment des paires de bases par liaison hydrogène avec la guanine.
Produits d’oxydation de la guanine potentiels causant les transersions G:C-C:G
Les structures de (a) paires de bases proposées Iz:G , (b) C:G et (c) Oz :G paires de bases
L’Iz est lentement hydrolysé en 2,2,4-triamino-5(2H)-oxazolone (Oz) (Fig. 1) en solution aqueuse neutre, et sa demi-vie est de 147 min dans des conditions physiologiques . De plus, 2 à 6 molécules d’Oz sont détectées pour 107 bases guanine dans l’ADN du foie, et il a été récemment démontré que la quantité d’Oz est significativement augmentée en présence de 5-méthylcytosine. Ainsi, l’influence biologique d’Oz dans la réplication de l’ADN est probablement plus importante que celle d’Iz.
Le fragment de klenow exo- incorpore l’adénine en face d’Oz in vitro , et Oz provoque des transversions G:C-T:A dans E. coli . En revanche, dans notre système de réaction in vitro, le fragment de Klenow exo- incorpore soit l’adénine, soit la guanine en face de Oz . De plus, nous avons révélé que les ADN polymérases α, β, δ et ε n’incorporent chacune que la guanine opposée à Oz ; les ADN polymérases γ, κ et l’ADN polymérase IV de Sulfolobus solfataricus, en plus du fragment exo de Klenow, incorporent chacune la guanine et l’adénine ; l’ADN polymérase η incorpore la guanine, l’adénine et la cytosine ; les ADN polymérases ζ et ι incorporent chacune la guanine, l’adénine, la cytosine et la thymine ; et REV1 incorpore la cytosine. Ces analyses indiquent que les ADN polymérases, à l’exception de REV1, incorporent la guanine en face de Oz . Nous avons prédit que Oz peut former une paire de bases stable avec la guanine, et que cette paire de bases Oz:G a deux liaisons hydrogène et est planaire (Fig. 3c) . Nous avons récemment réalisé des expériences de dénaturation thermique et rapporté que la paire de bases Oz:G est plus stable thermodynamiquement que Oz:A, Oz:C et Oz:T .
En outre, les ADN polymérases α, β, γ, δ, ε, η, κ et ζ allongent chacune l’amorce à pleine longueur à travers Oz . Ainsi, Oz semble être une lésion oxydée liée à l’induction des transversions G:C-C:G. En particulier, l’ADN polymérase ζ s’allonge au-delà de Oz avec presque la même efficacité qu’au-delà de G , mais pas au-delà du tétrahydrofurane (THF ; un analogue du site abasique chimiquement stable), de la 8-oxoG ou de la O 6-méthylguanine . Ces données indiquent que l’ADN polymérase ζ est une polymérase de réplication à risque d’erreur efficace pour Oz. De plus, seul REV1 incorpore la cytosine en face d’Oz, et la fréquence d’insertion de la cytosine suit l’ordre Oz > guanidinohydantoin (Gh) > THF > 8-oxoG . Étant donné que REV1 peut interagir avec les ADN polymérases , les résultats collectifs obtenus à ce jour suggèrent que REV1, conjointement avec l’ADN polymérase ζ, pourrait empêcher les transversions G:C-C:G . De tels systèmes de prévention des mutations sont observés dans d’autres ADN polymérases .
Réaction des oligonucléotides contenant de l’oz avec les enzymes de réparation
Les cellules utilisent un certain nombre de mécanismes pour prévenir les effets mutagènes des types de dommages à l’ADN décrits ci-dessus, et disposent de diverses enzymes qui réparent les dommages à l’ADN tels que la 8-oxoG .
Les enzymes E. coli formamidopyrimidine ADN glycosylase et endonucléases III excisent Oz des oligomères d’ADN double brin . En outre, les NTH1 et NEIL1 humaines, qui sont des homologues des endonucléases III et VIII d’E. coli, éliminent l’Oz aussi efficacement qu’elles éliminent le 5-hydroxyuracile, et leur réactivité vis-à-vis de l’Oz est plus élevée que vis-à-vis du 8-oxoG . Comme Oz est plus sensible que 8-oxoG au traitement par la pipéridine, cette différence de réactivité dépend de la force de la liaison N-glycosidique .
Nous avons analysé les activités d’incision d’autres enzymes de réparation sur Oz. La glycosylase du dimère de pyrimidine du virus de Chlorella, qui présente une activité d’incision envers le dimère de pyrimidine du cyclobutane, réagit avec l’ADN double brin contenant Oz. Sa réactivité envers Oz est plus élevée que celle envers 8-oxoG, ce qui indique que la réactivité dépend de la force de la liaison N-glycosidique, comme pour NEIL1 et NTH1 humaines. Cependant, cette enzyme de réparation présente une activité modérée envers Oz par rapport à son activité envers le dimère de cyclobutane pyrimidine .
L’endonucléase IV, une endonucléase apurinique/apyrimidinique, a incisé Oz avec une activité observée d’un tiers à un quart de celle envers THF , mais avec une efficacité supérieure à son activité envers Gh. Ces résultats suggèrent que Oz pourrait être plus similaire structurellement à un site abasique que ne l’est Gh .
L’endonucléase V, qui présente une activité envers les résidus d’hypoxanthine, est également active envers Oz. Cette activité est plus faible que celle envers l’hypoxanthine à des concentrations élevées d’endonucléase V, mais l’endonucléase V reconnaît Oz beaucoup plus efficacement que Gh. L’endonucléase V peut reconnaître l’uracile mais pas la thymine, ce qui suggère que le groupe 5′-méthyle est critique pour la reconnaissance par l’endonucléase V . Comme décrit précédemment , contrairement à la structure en anneau fermé d’Oz (Fig. 1), Gh a une partie qui dépasse de l’anneau, similaire à la thymine. Ainsi, l’endonucléase V peut reconnaître Oz mais pas Gh.
L’endonucléase 1 humaine OGG1 et AP ne peut exciser les résidus Oz , et l’uracile-ADN glycosylase 1 monofonctionnelle sélective à un seul brin ne présente aucune activité d’incision envers Oz (données non présentées). La Mut Y d’E. coli ne peut pas agir sur les lésions Oz:G et Oz:A (données non présentées). Oz est un substrat faible pour la réparation par excision des nucléotides humains car le site endommagé est moins volumineux que celui des photoproduits de pyrimidine (6-4) pyrimidone, ce qui rend difficile la reconnaissance d’Oz par XPC-RAD23B .
Les données disponibles à ce jour indiquent que NEIL1 et NTH1 humaines sont les enzymes de réparation les plus probables pour Oz. Cependant, la NEIL1 humaine, la NTH1, les endonucléases III d’E. coli et la formamidopyrimidine ADN glycosylase peuvent toutes exciser Oz de l’ADN double brin, quel que soit le type de base opposé à Oz . Si la base opposée à Oz est l’adénine, la guanine ou la thymine avant la réparation par excision de base, l’information génétique est altérée lors des réplications ultérieures. Ainsi, il peut exister des enzymes inconnues qui peuvent éliminer Oz avec précision des oligonucléotides dans lesquels Oz est apparié à un C, tout comme l’OGG1 humain peut éliminer 8-oxoG. Alternativement, comme mentionné précédemment , REV1-ADN polymérase ζ peut empêcher les transversions G:C-C:G.
L’OzOz entrave-t-il la synthèse d’ADN par les ADN polymérases ?
Les guanines contiguës (GG), qui existent dans de nombreuses régions génomiques importantes telles que l’oncogène K-ras , sont plus facilement oxydées qu’une guanine unique en raison de leur potentiel redox plus faible . L’oxydation des séquences GG dans des conditions d’oxydation élevées entraîne une lésion de guanine oxydée contiguë. Nous avons précédemment rapporté que IzIz est produit par l’oxydation de GG dans l’ADN simple et double brin, suggérant que l’hydrolyse de ces molécules Iz produit deux molécules Oz contiguës (OzOz). On s’attend à ce que OzOz bloque la synthèse de l’ADN plus efficacement qu’un seul Oz et représente donc un dommage plus grave à l’ADN qu’un seul Oz.
Notre analyse a montré que l’ADN polymérase κ n’incorporait aucun nucléotide en face de OzOz . Le fragment Klenow exo- incorporait préférentiellement une adénine opposée à l’Oz 3′ des lésions OzOz, REV1 incorporait la cytosine, et l’ADN polymérase β incorporait la guanine . L’ADN polymérase α a incorporé la guanine, l’adénine et la cytosine en face des lésions 3′ Oz d’OzOz, et la guanine a été incorporée plus facilement que l’adénine et la cytosine . L’ADN polymérase ι a légèrement incorporé la guanine, l’adénine et la thymine . Qu’une base soit incorporée ou non, ces polymérases ne peuvent pas allonger l’amorce jusqu’à sa pleine longueur à travers les lésions OzOz .
En revanche, l’ADN polymérase η a allongé l’amorce jusqu’à sa pleine longueur à travers les lésions OzOz avec une efficacité modeste par rapport à travers les lésions de dimère de cyclobutane pyrimidine, la synthèse de la plupart des brins d’ADN s’arrêtant aux 3′ ou 5′ Oz d’OzOz . En revanche, l’ADN polymérase ζ a pu allonger efficacement l’amorce jusqu’à sa pleine longueur à travers OzOz , ce qui suggère que l’ADN polymérase ζ est une enzyme importante pour la synthèse de translations au-delà des molécules Oz simples et contiguës. En outre, l’ADN polymérase ζ incorpore tous les nucléotides opposés aux Oz 3′ et 5′ et est une ADN polymérase à erreur pour les OzOz.
Photooxydation dans l’ADN quadruplex
Les séquences riches en guanine telles que les télomères peuvent se replier en structures quadruplex . Dans l’ADN double brin , l’oxydation à un électron de la guanine dans les séquences de guanine contiguës dépend de la localisation de l’orbitale moléculaire la plus occupée (HOMO) . Contrairement à l’ADN double brin, la 3′-guanine de d(TGGGGT) est principalement oxydée dans l’ADN quadruplex, et l’HOMO estimé est localisé sur la 3′-guanine (Fig. 4b). Compte tenu de notre compréhension actuelle de l’ADN double brin et de l’ADN quadruplex , l’oxydation sélective à un électron de la guanine se produit à l’HOMO localisé, quelle que soit la structure de l’ADN.
L’équilibre proposé et l’HOMO de d(TGGGGT)4. a Modèles de G-quadruplexes empilés. Les plans bleus sont la guanine, et les boules rouges sont K+. b La localisation de l’HOMO. Les HOMO ont été calculés aux niveaux B3LYP/6-31G* . Ces figures sont adaptées de données rapportées précédemment
En revanche, les produits d’oxydation de la guanine dépendent de la structure de l’ADN. Par exemple, Iz est un produit majeur dans l’ADN simple brin, tandis que la 8-oxoG et la déhydroguanidinohydantoine (Ghox) sont principalement formées dans l’ADN quadruplex . Iz, 8-oxoG, Ghox et Gh sont formés dans l’ADN double brin, et sont également des produits d’oxydation majeurs trouvés dans l’ADN simple brin et quadruple brin .
Le mécanisme d’oxydation de la guanine dans l’ADN simple brin, double brin et quadruple brin peut être expliqué comme suit . L’oxydation à un électron de la guanine génère un cation radical guanine (G-+) , suivi de deux voies de dégradation (figure 5). Dans l’une des voies, G-+ est déprotoné en position N1, ce qui entraîne la génération d’Iz. Dans une autre voie, G-+ est hydraté et déprotoné, suivi par la génération de 8-oxoG, Ghox, et Gh. Il existe une liaison hydrogène entre le proton N1 de G-+ et le O6 de la guanine dans l’ADN quadruplex (figure 6a), et une liaison hydrogène est formée entre le proton N1 de G-+ et le N3 de la cytosine dans l’ADN double brin (figure 6b). Par conséquent, la déprotonation de G-+ est significativement inhibée dans l’ADN quadruplex et partiellement inhibée dans l’ADN double brin. Nous estimons que la facilité de déprotonation suit l’ordre suivant : ADN simple brin > ADN double brin > ADN quadruplex , et cet ordre explique les différences de produits d’oxydation dans chaque type de structure d’ADN.
Deux voies d’oxydation de la guanine
Déplacements de protons dans (a) la paire de bases G-+:G de l’ADN quadruplex et dans (b) la paire de bases G-+:C de l’ADN double brin
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