La recherche était encore en cours dans les années 1930 pour trouver un moyen d’utiliser la lumière directe et diffractée de tous les azimuts afin de produire des images de bon contraste d’objets non colorés qui n’absorbent pas la lumière. Les recherches menées par Frits Zernike à cette époque ont permis de découvrir des différences de phase et d’amplitude entre la lumière d’ordre zéro et la lumière déviée qui peuvent être modifiées pour produire des conditions favorables à l’interférence et à l’amélioration du contraste.

Les spécimens non colorés qui n’absorbent pas la lumière sont appelés objets de phase car ils modifient légèrement la phase de la lumière diffractée par le spécimen, généralement en retardant cette lumière d’environ 1/4 de longueur d’onde par rapport à la lumière directe non déviée qui traverse ou entoure le spécimen sans être affectée. Malheureusement, nos yeux, ainsi que les pellicules des appareils photo, sont incapables de détecter ces différences de phase. Pour réitérer, l’œil humain n’est sensible qu’aux couleurs du spectre visible (variations de la fréquence lumineuse) ou aux différents niveaux d’intensité lumineuse (variations de l’amplitude des ondes).

Dans les spécimens en phase, la lumière directe d’ordre zéro traverse ou entoure le spécimen sans déviation. Cependant, la lumière diffractée par le spécimen n’est pas réduite en amplitude comme dans un objet absorbant la lumière, mais est ralentie par le spécimen en raison de son indice de réfraction ou de son épaisseur (ou des deux). Cette lumière diffractée, qui accuse un retard d’environ un quart de longueur d’onde, arrive sur le plan de l’image en décalage (également appelé déphasage) par rapport à la lumière non déviée, mais, dans l’interférence, son intensité n’est pratiquement pas diminuée. Il en résulte que l’image au niveau de l’oculaire est si peu contrastée qu’elle rend les détails presque invisibles.

Zernike a réussi à concevoir une méthode – aujourd’hui connue sous le nom de microscopie à contraste de phase – pour que les objets de phase non colorés donnent des images de contraste comme s’ils étaient des objets d’amplitude. Les objets d’amplitude présentent un excellent contraste lorsque la lumière diffractée et la lumière directe sont déphasées (présentent une différence de phase) d’une demi-longueur d’onde. La méthode de Zernike consistait à accélérer la lumière directe d’un quart de longueur d’onde, de sorte que la différence de longueur d’onde entre la lumière directe et la lumière diffractée pour un spécimen en phase soit désormais de 1/2 longueur d’onde. Par conséquent, la lumière directe et diffractée arrivant au niveau de l’image de l’oculaire serait capable de produire une interférence destructive (voir la section sur la formation d’images pour les objets absorbants décrite précédemment). Une telle procédure a pour conséquence que les détails de l’image apparaissent plus sombres sur un fond plus clair. C’est ce qu’on appelle le contraste de phase sombre ou positif. Une illustration schématique de la configuration de base d’un microscope à contraste de phase est illustrée à la figure 1.

Un autre parcours possible, beaucoup moins souvent utilisé, consiste à s’arranger pour ralentir la lumière directe d’1/4 de longueur d’onde afin que la lumière diffractée et la lumière directe arrivent à l’oculaire en même temps et puissent interférer de manière constructive. Cette disposition permet d’obtenir une image claire des détails du spécimen sur un fond plus sombre, et est appelée contraste négatif ou lumineux.

La microscopie à contraste de phase a connu un grand succès et a fini par être largement appliquée, ce qui a valu à Zernike l’attribution du prestigieux prix Nobel de physique en 1953. La technique du contraste de phase a été saluée comme la plus grande avancée de la microscopie depuis un siècle. Le contraste de phase, en « convertissant » des spécimens de phase tels que du matériel vivant en spécimens d’amplitude, a permis aux scientifiques de voir des détails dans des objets non colorés et/ou vivants avec une clarté et une résolution jamais atteintes auparavant.

La méthode de Zernike implique la séparation de la lumière directe d’ordre zéro de la lumière diffractée au niveau du plan focal arrière de l’objectif. Pour ce faire, un anneau annulaire est placé en position directement sous la lentille inférieure du condenseur au niveau du plan focal avant du condenseur, conjugué au plan focal arrière de l’objectif. Lorsque le cône creux de lumière provenant de l’anneau traverse l’échantillon sans être dévié, il arrive au plan focal arrière de l’objectif sous la forme d’un anneau de lumière. La lumière plus faible diffractée par le spécimen est répartie sur l’ensemble du plan focal arrière de l’objectif.

Si cette combinaison était autorisée, telle quelle, à se diriger vers le plan image de l’oculaire, la lumière diffractée serait environ 1/4 de longueur d’onde derrière la lumière directe. Au niveau du plan image, la phase de la lumière diffractée serait déphasée par rapport à la lumière directe, mais l’amplitude de leur interférence serait presque la même que celle de la lumière directe. Le contraste du spécimen serait alors très faible.

Pour accélérer la lumière directe non déviée d’ordre zéro, une plaque de phase est installée avec un déphaseur en forme d’anneau fixé sur le plan focal arrière de l’objectif. La zone étroite de la plaque de phase est optiquement plus fine que le reste de la plaque. Par conséquent, la lumière non déviée qui traverse l’anneau de phase parcourt une distance plus courte en traversant le verre de l’objectif que la lumière diffractée.

Maintenant, lorsque la lumière directe non déviée et la lumière diffractée se dirigent vers le plan image, elles sont déphasées de 1/2 longueur d’onde l’une par rapport à l’autre. La lumière diffractée et la lumière directe peuvent maintenant interférer de manière destructive, de sorte que les détails du spécimen apparaissent sombres sur un fond plus clair (tout comme pour un spécimen absorbant ou amplitude). C’est une description de ce qui se passe dans le contraste de phase positif ou sombre.

Si la zone de déphasage annulaire de la plaque de phase devait être rendue plus épaisse que le reste de la plaque, la lumière directe est ralentie d’1/4 de longueur d’onde. Dans ce cas, la lumière d’ordre zéro arrive sur le plan de l’image en phase avec la lumière diffractée, et il y a interférence constructive. L’image apparaît claire sur un fond plus sombre. L’image apparaît claire sur un fond plus sombre. Ce type de contraste de phase est décrit comme un contraste négatif ou lumineux.

Parce que la lumière non déviée d’ordre zéro est beaucoup plus brillante que la faible lumière diffractée, une fine couche métallique transparente absorbante est déposée sur l’anneau afin d’amener la lumière directe et la lumière diffractée à un meilleur équilibre d’intensité afin d’augmenter le contraste. De plus, comme l’accélération ou le ralentissement de la lumière directe est calculé sur un quart de la longueur d’onde de la lumière verte, l’image de phase apparaîtra mieux si un filtre vert est placé dans le trajet de la lumière (un filtre interférentiel vert est préférable). Un tel filtre vert aide également les objectifs achromatiques à produire leurs meilleures images, puisque les achromats sont corrigés sphériquement pour la lumière verte.

Les accessoires nécessaires pour le travail en contraste de phase sont un condenseur à contraste de phase sous-stage équipé d’annuli et un ensemble d’objectifs à contraste de phase, chacun ayant une plaque de phase installée. Le condenseur possède généralement une position en fond clair avec un diaphragme d’ouverture et une tourelle rotative d’annuli (chaque objectif de phase de différents grossissements nécessite un annuli de diamètre croissant au fur et à mesure que le grossissement de l’objectif augmente). Chaque objectif de phase possède un anneau obscurci sur sa lentille arrière. De tels objectifs peuvent également être utilisés pour des travaux ordinaires en lumière transmise en fond clair avec seulement une légère réduction de la qualité de l’image.

L’équipement de phase, tel que fourni par le fabricant, comprend généralement un filtre vert et un télescope de phase. Ce dernier est utilisé pour permettre au microscopiste d’éclairer l’anneau du condenseur afin de le superposer sur l’anneau de la plaque de phase. Un jeu de vis de centrage dans le condenseur de substage permet de manipuler l’anneau pour l’aligner tout en observant le plan focal arrière de l’objectif avec le télescope de phase (ou à travers une lentille de Bertrand).

Pour configurer un microscope de phase (les cellules de la paroi de la joue sont un matériau d’essai facilement disponible), mettez au point l’échantillon avec l’objectif de phase 10X. Ensuite, configurez le microscope pour un éclairage de Köhler en utilisant la position fond clair (0) du condenseur. Cette étape critique permet d’assurer l’alignement correct de l’objectif, du condenseur et du diaphragme de champ du microscope. Une fois le microscope correctement aligné, ouvrez le diaphragme d’ouverture du condenseur et faites pivoter la tourelle du condenseur en position 10 (cela ouvre généralement automatiquement le diaphragme d’ouverture). Placez le filtre vert dans le trajet lumineux et retirez l’un des oculaires. Insérez le télescope de phase et, tout en observant l’arrière de l’objectif, utilisez les vis de centrage de l’anneau pour centrer l’anneau sur l’anneau de la plaque. Une lentille de Bertrand ou un oculaire à sténopé, si disponible, permettra de voir le plan focal arrière de l’objectif. Le centrage de l’anneau de phase est souvent plus facile à réaliser si l’échantillon est temporairement retiré du chemin lumineux. Après l’alignement de l’anneau de phase avec l’anneau, réinsérez l’oculaire et replacez l’échantillon à sa place sur la platine du microscope dans le chemin optique.

Répétez la même procédure pour chaque objectif, en vous assurant que la tourelle est tournée de manière à ce que l’anneau de phase approprié soit positionné pour correspondre au grossissement de l’objectif. Certains fabricants fournissent des annulus individuels à pousser, à centrer, qui peuvent être insérés dans la partie inférieure du condenseur d’Abbe commun. De tels dispositifs simples et peu coûteux donnent de bons résultats avec les objectifs de phase 10X, 20X et 40X, mais le condenseur ne peut en recevoir qu’un à la fois.

La microscopie de phase continue d’être un outil important et largement utilisé, en particulier pour le microscopiste qui étudie du matériel vivant et/ou non coloré, comme les cellules et les tissus en culture. Cette méthode est aussi actuellement utilisée simultanément avec la fluorescence de la lumière réfléchie pour révéler les zones d’un spécimen qui ne sont pas fluorescentes. Les techniques de microscopie de phase sont particulièrement utiles avec les spécimens qui sont minces et dispersés dans le champ de vision.

Il existe certaines limitations de la microscopie à contraste de phase :

• Les images de phase sont généralement entourées de halos autour des contours des détails. Ces halos sont des artefacts optiques, qui obscurcissent parfois les limites des détails.
• Les annuli de phase limitent effectivement l’ouverture numérique de travail du système optique jusqu’à un certain point, réduisant ainsi la résolution.
• Le contraste de phase ne fonctionne pas bien avec les spécimens épais en raison des déphasages qui se produisent à partir des zones légèrement au-dessous ou légèrement au-dessus du plan qui est au point. Ces déphasages brouillent l’image et déforment les détails de l’image.
• Les images de phase apparaissent grises si une lumière blanche est utilisée et vertes si un filtre vert est utilisé. Dans le passé, de nombreux microscopistes limitaient leur film au noir et blanc lorsqu’ils effectuaient une photomicrographie sur des spécimens de phase. Aujourd’hui, de nombreux films couleur reproduisent très efficacement le noir, le blanc et les niveaux de gris, notamment les films transparents équilibrés au tungstène de Fuji, Kodak et Agfa.

La microscopie en phase est un autre exemple de la façon dont la manipulation de la lumière au niveau de la lentille inférieure du condenseur de substage et au niveau du plan focal arrière de l’objectif a un effet significatif sur l’image qui est observée à travers l’oculaire.

Les auteurs ont contribué à la rédaction de cet article.