La microscopie confocale offre de nombreux avantages par rapport à la microscopie conventionnelle à large champ pour les applications des sciences de la vie. Elle permet de contrôler la profondeur de champ et de collecter des sections optiques en série à partir de spécimens épais. La microscopie confocale peut être utilisée pour créer des images 3D des structures à l’intérieur des cellules. L’examen de ces structures peut aider les chercheurs à observer le fonctionnement interne des processus cellulaires.
Dans les microscopes optiques conventionnels à grand champ, la fluorescence secondaire émise par un spécimen se produit souvent à travers le volume excité et obscurcit la résolution des caractéristiques qui se trouvent dans le plan focal de l’objectif. Les spécimens plus épais présentent un degré de fluorescence tellement élevé qu’une grande partie des détails est perdue. Les techniques de filtrage spatial éliminent la lumière hors foyer dans les spécimens dont l’épaisseur dépasse le plan focal immédiat.
Avancées de la microscopie confocale
La microscopie confocale à balayage laser et à disque rotatif permet aux chercheurs de générer des images 3D des organites au sein des cellules vivantes. Des images de haute qualité peuvent être obtenues à partir de spécimens préparés pour la microscopie à fluorescence conventionnelle. Il existe également un nombre croissant d’applications de biologie cellulaire qui nécessitent l’imagerie de cellules et de tissus fixes et vivants.
Les progrès récents de la microscopie confocale ont rendu possible des vues multidimensionnelles de cellules et de tissus vivants qui incluent des informations d’image en 3D au fil du temps. Ces informations sont présentées en plusieurs couleurs. Disposer de données temporelles collectées à partir d’expériences time-lapse ou par l’acquisition d’images en temps réel est un outil puissant pour la biologie cellulaire. Les capacités de la microscopie confocale augmentent au fur et à mesure que de nouveaux systèmes laser sont développés pour limiter les dommages aux cellules et que les vitesses de traitement et les capacités de stockage des ordinateurs augmentent.
Microscopie confocale à balayage laser
Le principal avantage de la microscopie confocale à balayage laser est de produire des sections optiques fines à travers des spécimens fluorescents dont l’épaisseur dépasse 50 micromètres. Les images sont recueillies en coordonnant les changements incrémentiels du mécanisme de mise au point fine du microscope (à l’aide d’un moteur pas à pas) avec l’acquisition séquentielle d’images à chaque étape.
Le contraste et la définition sont grandement améliorés par rapport aux autres techniques en raison de la réduction de la fluorescence de fond et de l’amélioration du rapport signal/bruit. Les artefacts qui se produiraient lors de la section physique ou de la coloration fluorescente par section optique sont également éliminés. Les spécimens vivants peuvent être examinés dans diverses conditions avec une clarté accrue.
Microscopie confocale à disque tournant
Le microscope confocal à disque tournant permet aux chercheurs d’utiliser des niveaux de lumière plus faibles et d’obtenir une physiologie cellulaire plus précise avec des concentrations de fluorophore plus faibles. Les avantages de fournir une imagerie plus efficace à des puissances laser plus faibles comprennent moins de photoblanchiment, de phototoxicité et est moins coûteux que les microscopes confocaux à balayage laser.
Les nombreux avantages que la microscopie confocale offre par rapport à la microscopie conventionnelle à large champ pour les applications des sciences de la vie aide les chercheurs à observer le fonctionnement interne des processus cellulaires.
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