Cardellini a obtenu son premier grand rôle en 1996 lorsqu’elle a décroché le rôle principal de Sarah dans la série pour enfants en direct du samedi matin d’ABC, Bone Chillers. Par la suite, elle a fait des apparitions dans des programmes en prime-time tels que Step by Step, Clueless, 3rd Rock from the Sun et Boy Meets World dans le rôle de Lauren, une fille qui s’interpose entre le couple vedette de la série. Cardellini a joué dans la première saison de la série AMC The Lot en 1999, et a passé l’été en Europe dans le cadre d’une production itinérante de Lancelot, une tragédie néerlandaise du XIVe siècle.
Cardellini a connu son premier grand succès lorsqu’elle a décroché l’un des rôles principaux de la série Freaks and Geeks de NBC, qui a débuté pendant la saison 1999-2000. Dans le rôle de Lindsay Weir, une étudiante d’honneur en pleine crise d’identité, Cardellini a obtenu des réactions positives qui l’ont ensuite catapultée vers la célébrité. Elle a joué dans l’adaptation en prises de vues réelles de Scooby-Doo en 2002, dans laquelle elle incarnait le personnage de Velma Dinkley. Elle a ensuite repris le rôle de Velma dans Scooby-Doo 2 : Monsters Unleashed, en 2004. En 2003, elle a rejoint le casting de la série hospitalière Urgences dans le rôle de Samantha Taggart, une infirmière à l’esprit libre. Cardellini a joué pendant six saisons dans ER, jusqu’au final de la série, « Et à la fin… », et a remporté avec le casting le TV Land ensemble Icon Award en 2009.
Son autre travail au cinéma comprend des rôles dans Dead Man on Campus, Strangeland, Good Burger, Legally Blonde, Brokeback Mountain (pour lequel elle a été nommée pour les prix d’ensemble Gotham et Screen Actors Guild), et un rôle principal dans le film Happy Madison Grandma’s Boy dans le rôle de Samantha. Elle a été la voix d’Ursula dans le jeu vidéo de rôle Gladius et la voix de Bliss Goode dans la série animée The Goode Family sur ABC. En 2007, Cardellini a été choisie pour incarner Clara, une amoureuse, dans la mini-série Comanche Moon de CBS, une préquelle de Lonesome Dove de 1989.
En 2010 et 2011, Cardellini est remontée sur scène avec le groupe de comédie Dr. God à Los Angeles et San Francisco, est apparue dans Kill the Irishman et Super, et a joué dans le film indépendant Return. Elle est apparue avec les membres du casting et les producteurs de Freaks and Geeks et Undeclared au Paley Center for Media PaleyFest le 12 mars 2011. Du 15 juin 2012 au 15 février 2016, elle a été la voix de Wendy dans la série Gravity Falls de Disney Channel.
Cardellini fait périodiquement de la voix sur le podcast et l’émission en direct The Thrilling Adventure Hour, sur les segments Sparks Nevada : Marshal on Mars segments. En 2013, elle a été choisie pour jouer Sylvia Rosen, un intérêt amoureux de Don Draper dans Mad Men. Pour sa performance dans Mad Men, elle reçoit une nomination au Primetime Emmy Award de la meilleure actrice invitée dans une série dramatique. À partir de 2015, elle a rejoint Kyle Chandler dans une nouvelle série dramatique Netflix Bloodline, des créateurs de Damages. La série a été annulée en 2016, et s’est terminée après sa troisième saison. La même année, elle a également eu un rôle principal dans le rôle de Sara Whitaker dans le film comique Daddy’s Home. En 2017, elle a repris son rôle dans la suite du film Daddy’s Home 2.
En août 2018, Cardellini a été choisie pour partager la vedette avec Christina Applegate dans la série de comédie noire Dead to Me de Netflix. La première a eu lieu le 3 mai 2019. Pour sa performance, elle a été acclamée par la critique et a été nommée au Primetime Emmy Award de la meilleure actrice principale dans une série comique.
En 2019, elle a joué dans le film d’horreur The Curse of La Llorona.
Il s’agit d’un film d’horreur.