Résultats et discussion

La structure tridimensionnelle de Mal d 1.0101 consiste en un feuillet β antiparallèle incurvé à sept brins (β1-β7) englobant une longue hélice à l’extrémité C-terminale de la protéine (α3) et deux hélices courtes consécutives (α1, α2) (Figure Figure11). Les bords du β-sheet sont formés par les brins β1 et β2, qui sont reliés par les hélices α1et α2 qui forment un support en forme de V pour la partie C-terminale de l’hélice α3. Au total, Mal d 1 contient environ 35 % de structure β-feuillets et environ 25 % de structure hélicoïdale, ce qui correspond bien aux estimations de structure secondaire obtenues par infrarouge et dichroïsme circulaire.33-35 Comme dans d’autres protéines de la famille PR-10, les brins β2 et β3 sont reliés par un motif de boucle riche en glycine (Gly46-Asn47-Gly48-Gly49-Pro50-Gly51).Ensemble, ces éléments structurels créent la grande cavité interne typique du repliement PR-10 canonique. D’après la figure 11B, il est évident que dans notre ensemble structurel RMN de Mal d 1, les éléments de structure secondaire sont très bien définis et homogènes du point de vue de la conformation dans les 20 modèles structurels. Seuls des niveaux légèrement élevés d’hétérogénéité conformationnelle sont observés pour certaines des boucles exposées au solvant qui relient les éléments de structure secondaire et l’extrémité C-terminale de la protéine.

Une caractéristique particulière du pli PR-10 est la grande cavité interne.Dans Mal d 1.0101, le volume de cette cavité36 est d’environ 2230 Å3, ce qui est comparable en taille à ceux des autres protéines PR-10.5 Comme dans l’allergène du pollen de bouleau Bet v 1 et d’autres allergènes alimentaires homologues, dans le Mal d 1, la majorité des acides aminés qui forment la surface de la cavité sont hydrophobes (Figure 22). Une grande proportion de la surface de la cavité interne est formée par les résidus d’acides aminés du β-feuilleton dont les chaînes latérales hydrophobes sont situées à l’intérieur de la protéine (Ile56 (β3), Val67(β4), Ile71 (β4), Tyr81 (β5), Tyr83 (β5),Leu85 (β5), Ile98 (β6), Tyr100 (β6), Ile113 (β7))ainsi que des résidus pointant vers l’intérieur dans la longue hélice amphiphileα3 (Val132, Val134, Ala139, Leu142, Phe143, Ile146), les deux hélices courtes α1 (Phe22, Val23) et α3 (Ala26, Ile30),et les régions de boucle (Ile38, Phe58, Tyr64, Ala90). En outre, quelques chaînes latérales polaires et chargées sont situées à l’intérieur de la molécule et font partie de la surface de la cavité, comme Asp27 (α2), His69(β4), Ser115 (β7), et Lys138 (α3), de sorte que la cavité elle-même est en fait amphiphile, comme cela a été noté précédemment pour le principal allergène du pollen de bouleau, Bet v 1.37 Dans les structures cristallines d’autres protéines PR-10, la cavité est occupée par de l’eau, des molécules de ligand amphiphiles, ou des composants du tampon de cristallisation.5 Pour Mal d 1, on ignore actuellement si les ligands se lient spécifiquement à la cavité ou quelle pourrait être la fonction biologique de la liaison des ligands.

(A) Cavité interne deMal d 1.0101, colorée selon le potentiel lipophile tel qu’implémenté dans MOE,32 où les régions hydrophiles sont colorées en bleu et les régions lipophiles sont colorées en jaune. (B) Représentation de surface de la structure de la solution de moindre énergie de Mal d 1.0101. Les deux entrées amphiphiles vers la cavité interne sont indiquées comme ε1 (entre l’extrémité N-terminale de l’hélice α3 et les boucles reliant les brins β3-β4 et β5-β6) et ε2 (entre le bord du feuilletβ et l’extrémité C-terminale de l’hélice α3).

La cavité interne de Mal d 1 peut être atteinte par deux ouvertures (Figure 22). Une entrée à l’intérieur de la protéine, ε1, est formée par les résidus de la moitié N-terminale de l’hélice α3 (His131, Val134) ainsi que les boucles reliant les brins β3-β4 (Gln63, Tyr64) et les brins β5-β6(Asp89). Ensemble, ces acides aminés créent une voie d’accès amphiphile à l’intérieur de la protéine. Une deuxième entrée amphiphile, ε2,est présente au bord du feuillet β entre l’hélice α3(Lys136, His140, Lys144, et Glu147) et le brin β1 (Asn7, Phe9,et Ser 11). Dans les structures de solution RMN de Mal d 1, cette voie d’accès est partiellement obstruée par la chaîne latérale de His140. Il convient de noter que des entrées dans la cavité interne à des endroits similaires ont également été décrites pour d’autres membres de la famille des protéines PR-10.5

La figure 33 montre une comparaison de Mal d 1 avec Bet v 1 et les allergènes alimentaires liés au pollen de bouleau de la famille PR-10 dont les structures ont été déterminées jusqu’à présent.Malgré le fait que les identités de séquence entre ces protéines ne sont que légèrement supérieures à 50% dans certains cas, leurs structures tridimensionnelles sont généralement très similaires, avec des valeurs de rmsd du squelette pour les structures secondaires généralement inférieures à 2 Å.38 À la lumière de la réactivité croisée immunologique observée entre Mal d 1 et l’allergène majeur du pollen de bouleau, Bet v 1, la comparaison structurelle de ces deux protéines est particulièrement intéressante. Le backbonermsd entre Mal d 1.0101 et l’isoforme hyperallergénique Bet v 1.0101(61% d’identité de séquence) de l’allergène du pollen de bouleau est de 2,13 Å(1,70 Å pour les éléments de structure secondaire). Il est à noter que la longueur de Mal d 1 et de Bet v 1 diffère d’un acide aminé, et que des présomptions divergentes ont été faites quant à l’emplacement de la lacune dans Mal d 1. Sur la base des alignements de séquences des allergènes alimentaires PR-10, il a été proposé que la boucle juste avant39,40 ou juste après4,34,41,42 le brin β7 soit plus courte d’un résidu dans Mal d 1. Notre structure de solution montre que la boucle juste avant le brin β7 est celle qui est plus courte en Mal d 1.0101. Les brins β6 (Glu96-Val105 dans Mal d 1.0101 et Bet v 1.0101) et β7 (Ser111-Thr121 dans Mal d 1.0101 et Ser112-Thr122 dans Bet v 1.0101) occupent des positions identiques et ont des motifs de liaison hydrogène égaux dans les feuilletsβ antiparallèles de ces protéines. Ils sont connectés via des boucles constituées de quatre résidus (Cys-Gly-Ser-Gly dans Mal d 1) et de cinq résidus (Thr-Pro-Asp-Gly-Glyin Bet v 1), respectivement, ce qui produit une petite différence structurelle dans ces segments de boucle entre les deux protéines.

Le Mal d 1 est connu pour avoir une tendance à la dimérisation médiée par la cystéine, comme cela a été montré pour l’isoforme Mal d 1.0108 par électrophorèse sur gel non réducteur et chromatographie d’exclusion de taille.35 Comme le Mal d 1.0108, l’isoforme Mal d 1.0101 contient un seul résidu cystéine, Cys107. Dans la structure tridimensionnelle en solution de la Mal d 1.0101, la Cys107 est située à l’extrémité C-terminale du brin β7,avec sa chaîne latérale orientée vers la surface de la protéine. Pour sonder l’état d’oligomérisation de la Mald 1.0101 dans les conditions que nous avons employées pour la détermination de la structure par RMN (pH 6,9, sodiumphosphate 10 mM, acide l-ascorbique 14 mol équiv, 298 K), nous avons réalisé des expériences de diffusion RMN à gradient de champ pulsé. Nous avons obtenu une valeur de 21,6 ± 0,8 Å pour le rayon hydrodynamique de Mal d 1.0101, ce qui est comparable au rayon hydrodynamique de Bet v1.0101 monomère (20,1 Å) dans des conditions expérimentales similaires.21 Ceci est cohérent avec notre observation que, en utilisant le même tampon, Mal d 1.0101 élue d’une colonne d’exclusion de taille avec un temps de rétention qui est pratiquement identique à celui de Bet v1.0101. Ces résultats ont également été vérifiés par spectrométrie de masse FT-ICR,qui montre que Mal d 1.0101 ne forme pas de dimères ou d’agrégats d’ordre supérieur.

La structure de solution RMN de Mal d 1 montre que cette protéine est constituée d’un feuillet β antiparallèle fortement courbé et de trois hélices α formant une grande cavité interne, de façon très similaire aux autres protéinesPR-10.5 Ceci est en accord avec la réactivité croisée immunologique observée entre Mal d 1 et le principal allergène du pollen de bouleau, Bet v 1, ainsi que d’autres allergènes alimentaires de la famille des protéines PR-104,43. Chez la plupart des patients, Betv 1 est l’agent sensibilisant, tandis que les IgE spécifiques de Bet v 1 réagissent ensuite de manière croisée avec Mal d 1 et provoquent une réponse allergique, comme le montre l’observation clinique selon laquelle l’allergie à la pomme se développe peu après le début de la pollinose du bouleau44.

Dans cette optique, des expériences d’inhibition croisée de Mal d 1usingsera provenant de patients allergiques à la pomme ont montré que Mal d 1 partage des épitopes IgE avec le principal allergène du pollen de bouleau, Bet v 1.4,43 D’un point de vue structurel, des informations limitées sur la nature exacte des épitopes de liaison de Mal d 1 et Bet v 1 sont disponibles. Des informations structurales détaillées sur un épitope de cellule B séquentiellement discontinu (c’est-à-dire, On a obtenu des informations structurelles détaillées sur un épitope de cellule B séquentiellement discontinu (c’est-à-dire conformationnel) dans Bet v 1 en cocristallisant l’isoforme particulière Bet v 1.0112 avec un fragment de liaison à l’antigène (Fab) dérivé de l’anticorps monoclonal IgG murin BV16.45 Cet épitope est formé par le segment entre Glu42 et Thr52 (incluant le motif de boucle riche en glycine entre les brins β2 et β3),ainsi que Arg70, Asp72, His76, Ile86, et Lys97 de Bet v 1, couvrantenviron 10% (≈900 Å2) de la surface entière des protéines. La liaison de BV16 à cet épitope réduit de manière mesurable les interactions sérumIgE, ce qui indique que l’IgE et l’IgG monoclonale BV16 sont en compétition pour des surfaces de liaison qui se chevauchent sur Bet v 1.46 De plus, la mutation d’un résidu central (Glu45→Ser) a réduit de manière significative la capacité de liaison à l’IgE de Bet v 1, confirmant l’importance de cet épitope particulier pour les interactions avec l’IgE.46

La figure44A montre la surface d’interaction moléculaire qui correspond à l’épitope BV16 de l’allergène de la pomme. Dans Mal d 1, ces résidus forment un patch de surface contigu avec un résidu quelque peu distal (Glu76), similaire en forme et en taille à l’épitope BV16 de Bet v 1. De plus, les acides aminés contributeurs sont largement conservés entre Mal d 1 et Bet v 1. Treize des 16 acides aminés de l’épitope BV16 sont identiques, alors que seulement 3 résidus sont différents dans Mal d 1.0101 et Bet v 1.0101 (Figure 44B). Ces données fournissent donc une justification structurelle de la réactivité allergique croisée observée entre le pollen de bouleau et les allergènes de pomme. De manière intéressante, des études mutationnelles indiquent que la capacité de Mal d 1 à lier les IgE sériques de patients allergiques au pollen de bouleau peut être augmentée en augmentant la similarité de l’épitope BV16 de Mal d 1 avec celui de Bet v 1,ce qui indique que ces acides aminés sont effectivement impliqués dans la liaison deBet v 1 spécifique à Mal d 1.39

(A)pitopes conformationnels de Mal d 1. Les résidus d’acides aminés quicorrespondent à la surface d’interaction moléculaire entre l’IgG monoclonal BV16 et Bet v 1.0112 (résidus Glu42-Thr52, Arg70, Asp72,Glu76, Ile86, et Lys97 dans Mal d 1.0101) sont colorés en bleu45. Les positions d’acides aminés qui se sont avérées cruciales pour la reconnaissance de Mal d 1 par les IgE dans les analyses mutationnelles (Thr10, Ile30, Thr57, Ser111, Thr112, et Ile113) sont indiquées en vert (Ile30 et Ile113 sont situées à l’intérieur de la protéine et ne contribuent pas à la surface).13,34 (B) Similitudes d’acides aminés entre Bet v 1.0101 et Mal d 1.0101 en utilisant un gradient de couleur allant du lilas (très similaire) au sarcelle (très dissemblable). Les résidus d’épitope qui sont différents entre Bet v 1.0101 et Mal d 1.0101 sont marqués. Les similarités ont été calculées sur la base de scores de matrice de substitution (BLOSUM62) tels qu’implémentés dans MOE.32

Il est probable que Mal d 1 contienne plus d’un seulpitope conformationnel.47 Un certain nombre de positions d’acides aminés pertinentes pour la reconnaissance des IgE ont été identifiées par analyse mutationnelle.13,34 Pour un mutant à cinq points de Mal d 1.0108(Thr10→Pro, Ile30→Val, Thr57 →Asn, Thr112→Cys,et Ile113→Val), une capacité nettement réduite de liaison des IgE spécifiques de Mal d 1 a été trouvée in vitro.34 Des tests de piqûre cutanée chez des patients allergiques à la pomme comparant Mal d 1 de type sauvage au mutant à cinq points ont en outre montré une capacité significativement plus faible de la protéine mutante à induire des réactions cutanées in vivo.48 Des expériences supplémentaires ont montré que le niveau de reconnaissance des cellules T de Mal d 1 de type sauvage est conservé dans le mutant à cinq points.34 Comme ces cinq acides aminés sont probablement impliqués dans les interactions IgE non seulement dans le Mal d 1 mais aussi dans le Bet v 1, ils pourraient bien faire partie d’épitopes communs à réaction croisée dans ces deux allergènes49. Ceci est corroboré par des études mutationnelles, qui ont montré que les tronçons peptidiques englobant ces résidus sont effectivement impliqués dans la réactivité croisée immunologique entre Mald 1 et Bet v 1.50 En outre, dans une étude indépendante, Ser111 a été identifié comme étant essentiel pour la liaison des IgE àMal d 1, et une mutation Ser111→Cys a entraîné une affinité significativement réduite pour les IgE dans les expériences d’immunoblotting.13

La figure44A montre que ces six résidus sont assez dispersés sur la surface protéique de Mal d 1 et qu’aucun de ces acides aminés ne chevauche l’épitopeBV16. Les acides aminés Thr10, Ser111, et Thr112 forment un patch commun à la surface de la protéine, alors que Thr57 est situé à environ 37-39 Å et proche de l’épitope BV16. Considérant qu’un épitope de taille typique (∼600-900 Å2)39 et de forme circulaire aurait une longueur d’arc de 28-34 Å sur la surface de Mal d 1, les résidusThr10, Ser111, et Thr112 sont probablement trop éloignés de Thr57 pour faire partie d’un épitope de liaison commun. Les deux autres résidus, Ile30 et Ile113, n’atteignent pas la surface de la protéine dans Mal d 1. Alors que Ile113 est proche dans l’espace du patch Thr10-Ser111-Thr112, sa chaîne hydrophobe est dirigée vers l’intérieur de la protéine, où elle participe à un petit noyau hydrophobe situé à l’extrémité interne de la cavité de la protéine (entre les hélices α1 et α3 et le feuillet β). Le résidu Ile30 est également situé à l’intérieur de la protéine avec sa chaîne latérale aliphatique faisant partie de la cavité interne et ne contribue pas à la surface de la protéine.

À noter,parce que la boucle entre les brins β6 et β7 est plus courte d’un résidu dans Mal d 1 que dans Bet v 1, Ser111 et Thr112de β7 dans Mal d 1 occupent les positions β7 de Ser112 etIle113 dans Bet v 1. Le patch de surface formé par Thr10, Ser111, etThr112 dans Mal d 1 semble donc être moins hydrophobe que le patch de surface correspondant dans Bet v 1 (Thr10, Ser112, et Ile113). En fait, la surface protéique entourant ces trois résidus présente un niveau de similarité considérablement plus faible entre le Mal d 1.0101 et le Bet v 1.0101 que les autres parties de la surface protéique, comme on peut le voir sur la figure 44B. Cela pourrait être en partie responsable des différentes propriétés de liaison aux IgE de ces allergènes. Il a été noté, d’autre part, que la coïncidence épitoïque entre Bet v 1 et Mal d 1 peut être limitée,47 comme l’illustre une étude récente décrivant l’isolement d’IgE humaines se liant à Bet v 1 mais pas à Mal d 1.51 De plus, différentes isoformes de Mal d 1 contiennent des substitutions d’acides aminés au sein des surfaces d’interaction potentielles des IgE,39 suggérant qu’elles peuvent influencer la réaction immunologique.

Il est clair que les données structurelles à haute résolution fournissent la base pour déterminer et comparer les détails structurels des épitopes de liaison (à réaction croisée) dans les protéines allergènes. En outre, le greffage d’épitopes conformationnels par transfert de tronçons de résidus entre allergènes homologues est devenu un outil expérimental précieux. Le greffage d’épitope a été utilisé pour caractériser le rôle de l’épitope BV16 dans le Mal d 1 en recréant cet épitope sur la surface du Mal d 1, confirmant son importance pour la liaison des IgE et la réactivité croisée avec le Bet v 1.39 Dans une approche orthogonale, plusieurs segments de Mal d 1 englobant des résidus cruciaux pour la liaison des IgE ont été transférés à Bet v 1 pour étudier le rôle de ces segments structurels dans la réactivité croisée,50 et des chimères de Bet v 1 et Mal d 1 ont été créées pour faire correspondre l’épitope d’une IgE monoclonale humaine, isolée à partir d’une phagothèque, à l’extrémité C-terminale de Bet v 1.51 En outre, la greffe d’épitope permet d’accéder à des allergènes chimériques dotés de propriétés antigéniques finement ajustées, telles que des capacités réduites de liaison aux IgE, pour le diagnostic d’allergie basé sur des molécules et l’immunothérapie spécifique52. La connaissance des détails structurels de ces éléments allergènes est nécessaire pour générer des chimères correctement repliées, car le transfert de tronçons de structure secondaire (partiellement) mal assortis entre différents allergènes pourrait bien être la raison d’une perte de repliement de la protéine et, par conséquent, d’une réduction des capacités de liaison aux IgE.41 La structure tridimensionnelle de Mal d 1,0101 présentée ici fournit la base biophysique pour élucider les détails moléculaires de la réactivité croisée immunologique de façon très détaillée.