DISCUSSION

Dans cette étude, nous présentons les structures de solution SAXS pour l’Hb et l’Hb conjuguée avec deux ou six à sept copies de PEG de 5-kD. Il s’agit du premier exemple de détermination structurelle 3D d’une hémoglobine conjuguée au PEG, bien qu’à basse résolution. Les résultats les plus importants de cette étude sont les suivants : i), la conjugaison du PEG n’induit pas de distorsion importante de la structure tertiaire de l’Hb (à cette résolution), mais sa structure quaternaire semble compacte ; ii), une partie des chaînes de PEG pénètre dans les cavités entre les sous-unités de l’Hb, une partie reste près de la surface de la protéine, et le reste dépasse de la surface ; iii), la PEGylation change la molécule sphérique d’Hb en une structure allongée avec soit deux ou six PEG conjugués ; iv), la conjugaison des PEG entraîne une répulsion entre les molécules d’Hb PEGylées causée par la couche de PEG qui entoure la protéine Hb, ce qui se manifeste par un effet de concentration marqué dans les données SAXS.

La diffusion expérimentale de l’Hb est bien ajustée par la courbe calculée à partir de la structure cristalline de l’oxyHb, tandis que la structure cristalline de la désoxyHb donne un ajustement moins bon. P5K2 et P5K6 sont toutes deux conjuguées à la Cys-β93 adjacente à la His-β92 proximale, qui est le seul résidu des sous-unités β de Hb directement coordonné au fer de l’hème. Il semble probable que la fixation d’un PEG de 5-kD provoque des distorsions structurelles locales et mineures de la poche de l’hème de la sous-unité β qui ne sont pas détectables à cette résolution (∼12 Å). Ceci est soutenu par des études sur la cinétique de perte d’hème qui est 5 fois plus élevée pour la sous-unité β de P5K6 par rapport à l’Hb non conjuguée, alors que les sous-unités α présentent une cinétique similaire à celle de l’Hb (8). Conformément à cette interprétation, les études de RMN 1H d’une Hb conjuguée au PEG, dont la structure chimique est similaire à celle de la P5K6 étudiée ici, ont montré un décalage de l’histidine proximale des sous-unités β- mais pas α (28). De plus, les résidus à proximité de la Cys-β93 sont situés dans une région conformationnellement plastique qui est directement liée aux propriétés allostériques de Hb (29,30).

La modification des résidus Cys-β93 avec le N-éthyl maléimide seul entraîne une perte de coopérativité, et cet effet, ainsi que la compaction de la structure quaternaire, peut expliquer la perte apparente de coopérativité dans Hemospan (5). Le mouvement quaternaire pourrait être restreint, ne donnant lieu qu’à une transition partielle entre les états R et T ou à une structure quaternaire intermédiaire. Un tel effet a été envisagé précédemment pour interpréter la cinétique de la liaison de l’O2 à Hemospan (7).

Etant donné que les portions grand angle de la diffusion de Hb et de PEG-Hb coïncident, des changements significatifs de structure tertiaire/secondaire dus à la PEGylation peuvent être exclus, et nos résultats indiquent donc une structure quaternaire plus compacte de la protéine PEGylée. Cela peut s’expliquer par une déshydratation partielle des interfaces intersous-unités causée par les chaînes de PEG, qui sont, de manière plutôt inattendue, partiellement situées à l’intérieur des PEG-Hbs. La structure quaternaire de l’oxyHb crée une cavité centrale entre les quatre sous-unités de l’hémoglobine. Cette cavité peut accueillir au moins 80 molécules d’eau, comme le montre la structure cristalline à haute résolution de l’oxyHb (27). Par conséquent, le volume est suffisant pour que le PEG pénètre dans l’interface intersous-unité et déplace les molécules d’eau situées à l’intérieur du tétramère. De plus, le PEG est connu pour provoquer la déshydratation et est souvent utilisé comme cosolvant pour la cristallisation des protéines. En conjonction avec le déplacement des molécules d’eau situées dans la cavité centrale, une déshydratation générale peut contribuer à la structure quaternaire compacte du PEG-Hbs. Cette conclusion est cohérente avec les simulations de dynamique moléculaire qui ont montré une corrélation entre l’étendue de la PEGylation et le volume moléculaire du PEG-Hb, avec un déplacement correspondant des molécules d’eau de la structure de l’Hb (31).

Comme la majeure partie des chaînes de PEG est située à l’extérieur de l’Hb, nos résultats sont en accord avec des études antérieures montrant que le PEG est préférentiellement exclu des protéines par exclusion stérique (32). De plus, mais en concurrence avec les forces d’exclusion, il a été démontré que le PEG interagit avec les résidus non polaires de la surface des protéines (32), et une interaction du PEG de 5 kD a été signalée pour les amas hydrophobes à la surface du cytochrome c (33). Le score d’hydrophobie pour Hb a été calculé selon Kyte et Doolittle (34) (Fig. 6), montrant les numéros de résidus alignés avec les segments hélicoïdaux. Une région particulièrement intéressante pour les interactions PEG-Hb possibles se trouve sur les hélices G-H relativement hydrophobes au niveau des contacts d’emballage α1β1 entre les dimères. Nos modèles montrent des interactions de surface du PEG avec Hb, bien que la résolution soit insuffisante pour définir les résidus Hb impliqués ou leur polarité. L’analyse des spectres SAXS enregistrés à une concentration relativement élevée de protéine montre un effet de concentration clair pour P5K2 et P5K6, alors que cet effet est presque absent dans l’Hb non conjuguée. Comme on pouvait s’y attendre, l’effet de concentration est plus prononcé pour P5K6 que pour P5K2, ce qui suggère que l’introduction de chaînes PEG supplémentaires entraîne un meilleur blindage de la molécule d’Hb, ce qui est également en accord avec les calculs de dynamique moléculaire des Hbs théoriques conjuguées au PEG (31).

Intuitivement, on s’attendrait à ce que les PEG-Hbs aient la même forme que l’Hb non PEGylée, mais nous montrons ici que la forme d’une protéine PEGylée n’est pas définie par celle de la protéine centrale. La forme non sphérique de la solution des PEG-Hbs n’était pas prévue et fournit de nouvelles informations permettant de calculer les constantes de diffusion des PEG-Hb à l’aide de l’équation de Stokes-Einstein. Nous avons rapporté des simulations du transport de l’oxygène par des Hbs acellulaires, y compris le PEG-Hb, où la diffusion moléculaire de l’Hb s’est avérée être un facteur critique dans le transport global de l’oxygène (35). Bien que la conclusion soit valable, cette étude a utilisé l’hypothèse simplificatrice que les molécules d’Hb étaient sphériques. Puisque la structure de la solution SAXS contredit cette hypothèse, les dimensions moléculaires correctes peuvent maintenant être employées pour fournir des simulations plus précises.

De plus, bien que P5K2 et P5K6 aient des formes et des dimensions globales similaires, la différence dans l’effet répulsif des particules en solution fournit une propriété hautement critique qui peut expliquer certains des effets positifs des Hbs PEGylés in vivo. La généralité de ces observations peut être attribuée aux chaînes PEG attachées et suggère que l’effet de concentration est une conséquence générale de la conjugaison PEG. En conséquence, in vivo, on peut supposer que cet effet empêche non seulement les interactions intermoléculaires entre les protéines adjacentes conjuguées au PEG, mais aussi entre les protéines conjuguées et non conjuguées, voire les structures cellulaires.

Plusieurs avantages généraux, tels que l’augmentation du temps de rétention intravasculaire, la diminution de l’immunogénicité et l’amélioration de la solubilité, sont fréquemment associés à la fixation d’un polymère PEG à une protéine. Par exemple, la fixation d’un polymère PEG ramifié de 40 kDa à l’interféron-β-1b a nettement amélioré sa demi-vie circulante, qui est passée de 1,1 h pour la protéine non conjuguée à 9,4 h pour le médicament conjugué au PEG ; de plus, la fixation du PEG a considérablement réduit l’immunogénicité de la protéine et la tendance à l’agrégation (4). La capacité du PEG-Hb à exclure d’autres protéines ou cellules à l’intérieur de son volume d’exclusion est particulièrement importante pour la conception de produits thérapeutiques à base d’oxygène. Les produits à base d’hémoglobine sont optimisés pour prolonger le temps de circulation, tout en minimisant ou en éliminant la toxicité. Ce résultat est cohérent avec la demi-vie circulatoire prolongée d’Hemospan, qui est de ∼20 h en l’absence d’hémoglobinurie (14), par rapport à la clairance rénale très rapide de l’Hb non modifiée et sans cellules (36). La prolongation du temps de circulation d’Hemospan peut survenir s’il ne se lie pas au récepteur CD163 des macrophages, un capteur d’Hb qui montre une liaison progressivement décroissante des Hbs polymérisées avec l’augmentation de la taille (37). Des études avec Hemospan dans ce système sont en cours. En outre, la répulsion des PEG-Hb par les autres cellules immunitaires peut être essentielle pour éviter les réponses inflammatoires. Les théories dominantes sur la vasoconstriction induite par l’hémoglobine acellulaire sont que les molécules d’Hb se rapprochent de l’endothélium (38) ou s’extravasent à travers l’endothélium (39), ce qui rendrait le piégeage du NO plus efficace, entraînant ainsi une augmentation du tonus vasculaire et des effets secondaires négatifs d’hypertension et de diminution de la perfusion (40). Cela reste spéculatif à ce stade, mais la nature répulsive de la modification PEG peut réduire son interaction avec le glycocalyx de surface des cellules endothéliales ; ainsi, l’effet répulsif fournit une explication à la vasoactivité moindre avec Hemospan (10).

Ces nouvelles connaissances issues de cette analyse SAXS peuvent maintenant être utilisées pour concevoir des PEG-Hbs pour des effets de répulsion maximaux ou optimaux et la taille des particules et les conformations PEG. Les forces de répulsion intermoléculaires augmentent considérablement avec la masse totale des PEG conjugués de même longueur de polymère (10 vs ∼30 kD pour P5K2 versus P5K6), un effet qui n’était pas prédit par les changements de forme et/ou de dimensions moléculaires. Ainsi, les conformations en solution des PEG conjugués, qui incluent son interaction avec Hb, d’autres polymères PEG et les couches d’eau environnantes, doivent jouer un grand rôle dans l’effet de répulsion.

Les longueurs effectives des PEG sont définies par la dimension de Flory, RF, qui est déterminée à partir de la longueur effective d’une unité oxyéthylène, a = 3.5 Å (41), et du nombre d’unités par polymère, N (42-44):

Les dimensions relatives de RF et la distance entre les sites de greffage du PEG, DG, sur une surface déterminent la structure secondaire du polymère PEG greffé : pour DG > RF, le polymère PEG est capable de se replier sur lui-même sur la surface greffée, donnant une conformation  » champignon  » ; pour DG < RF, les PEG s’étendent en raison des interactions stériques entre les chaînes de PEG pour former une conformation  » brosse  » ; et pour DG ≈ RF, les PEG sont dans une phase de transition  » champignon-brosse  » (45). Pour le PEG 5-kD, N = 113 et RF ∼ 60 Å. Comme la circonférence demi-maximale DG sur la surface de Hb d’une Cys-β93 à l’autre sur le côté symétriquement opposé de Hb est ∼110 Å, DG > RF, permettant ainsi une conformation en champignon des polymères PEG greffés dans P5K2. Cela se reflète dans les caractéristiques du PEG de la structure SAXS de P5K2, montrant une forme ellipsoïdale globale avec Dmax = 115 Å. Le calcul du diamètre maximal pour P5K2 en utilisant la dimension de Flory pour le PEG 5-kD donne une molécule avec Dmax ∼ 190 Å (c’est-à-dire, Diamètre de l’Hb = 70 Å + PEG, 2 × 60 Å), fournissant ainsi une estimation de la conformation en champignon des chaînes PEG sur P5K2 qui se replient à ∼60% de leurs dimensions de Flory complètes.

La molécule P5K6 plus fortement coordonnée par le PEG contient les deux sites d’attachement spécifiques (Cys-β93) et quatre à cinq sites supplémentaires greffés par le PEG. La structure de solution SAXS implique que les chaînes PEG de P5K6 ont une plus grande interaction stérique pour former une forme encore plus allongée par rapport à P5K2 (Fig. 4). En utilisant une approximation selon laquelle les chaînes PEG sont uniformément réparties sur la surface de Hb, la DG est diminuée à ∼55 Å, et DG ≈ RF, suggérant ainsi une conformation PEG plus étendue mais toujours dans une transition champignon-brosse. En utilisant la dimension de Flory maximale comparée à la Dmax mesurée = 130 Å, les chaînes de PEG de 5-kD sur P5K6 semblent se replier à ∼70% de leur dimension de Flory complète, ce qui est cohérent avec une augmentation de l’extension du PEG dans P5K6 par rapport à P5K2 par des contraintes stériques.

Par la détermination directe de la taille des particules par SAXS combinée à l’analyse de Flory, nous avons prédit que P5K6 se trouve dans une transition champignon-brosse et n’a donc pas été conçu pour atteindre sa taille de particule maximale lorsque les PEG conjugués sont complètement étendus. De nouvelles molécules PEG-Hb peuvent être conçues pour des particules plus grandes, telles que la DG < RF soit par : 1), créant une Hb plus fortement conjuguée avec plus de sites d’attachement PEG, diminuant ainsi la DG, ou 2), augmentant la longueur du PEG, augmentant ainsi la RF. En doublant la taille du PEG à 10 kD (c’est-à-dire P10Kx, où x est le nombre de sites de conjugaison), on augmente la RF à ∼90 Å, ce qui, selon nos prévisions, donnerait une conformation en champignon dans P10K2 mais se rapprocherait d’une conformation en brosse plus complète dans P10K6. On ne sait cependant pas comment l’extension des longueurs de polymère PEG modifie les interactions stériques pendant la réaction de conjugaison chimique PEG-Hb, et donc les nouvelles conceptions justifient une pratique expérimentale avec des rapports de réaction en conjonction avec des études SAXS pour vérifier le point de transition champignon-brosse.