O ADN celular é constantemente oxidado por vários agentes endógenos e exógenos, e os danos de ADN resultantes podem aumentar o risco de desenvolver cancro e outras doenças . A guanina tem o menor potencial redox das quatro bases de ADN e é, portanto, a mais facilmente oxidada.
Replicação do ADN, a incorporação de adenina oposta a um produto de oxidação da guanina induz uma transversalidade G:C-T:A, enquanto a incorporação de guanina oposta a um produto de oxidação da guanina causa uma transversalidade G:C-C:G. Estas mutações (ver referências em ) encontram-se em muitos genes importantes, e em particular nos sítios CpG no gene supressor de tumores p53 e nos códões 12 e 13 do K-ras oncogene . Portanto, é importante analisar a incorporação de nucleótidos e a extensão de ADN para cada produto de oxidação da guanina a fim de elucidar os mecanismos subjacentes à geração de G:C-T:A e G:C-C:G transversais.
8-Oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) (Fig. 1) é uma das lesões mais comuns de ADN oxidativo e é formada sob várias condições oxidativas. O 8-OxoG foi estudado extensivamente, tem um impacto biológico significativo, e é um marcador omnipresente de ADN oxidante danificado. As análises estruturais revelaram que o 8-OxoG adopta ou uma conformação anti ou sinusoidal: o 8-OxoG nas formas de anti conformação forma pares de base Watson-Crick com citosina, enquanto que a lesão na conformação sinusoidal utiliza a borda Hoogsteen da lesão para formar um par de base com adenina (Fig. 2). Além disso, as DNA polimerases incorporam adenina em adição à citosina oposta à 8-oxoG , e a 8-oxoG induz uma G:C-T:A transversal em células Escherichia coli (E. coli) e mamíferos .
>div>>p> produtos de oxidação da guanina>/div>
Embora 8-oxoG cause G:C-T:A transversões, o mecanismo subjacente à geração de G:C-C:G transversões não pode ser explicado por 8-oxoG. Além disso, 8-oxoG é mais facilmente oxidado do que a guanina devido ao seu menor potencial de oxidação, e assim várias lesões oxidativas são produzidas pela oxidação de 8-oxoG. Portanto, é necessário estudar tanto o 8-oxoG como outras lesões oxidadas da guanina a fim de compreender os vários fenómenos causados pela oxidação da guanina.
Os produtos de oxidação da guanina que causam as transversões G:C-C:G formam pares de bases por ligação de hidrogénio com a guanina
Como mencionado anteriormente, a transversalidade G:C-C:G é causada pela incorporação de guanina em oposição a um produto de oxidação da guanina. Nesta secção, descrevemos primeiro a “regra A”. A adenina é a base mais comum incorporada em frente a um sítio abásico por polimerases de ADN , sugerindo que, das quatro bases naturais, a adenina forma as interacções mais hidrofóbicas e exibe a melhor compatibilidade espacial com um sítio abásico. A incorporação da adenina pode não requerer necessariamente a formação de ligações de hidrogénio com vários sítios de ADN danificados no ADN modelo. Em contraste, a inserção preferencial da guanina requer a formação de ligações de hidrogénio, além de interacções hidrofóbicas e compatibilidade espacial, com a base do modelo. Assim, a fim de revelar as lesões causadoras de transversos G:C-C:G, é importante investigar os produtos de oxidação da guanina que formam pares de bases por ligação de hidrogénio com a guanina.
Potencial produtos de oxidação da guanina causando transersões G:C-C:G
Iz é lentamente hidrolisado a 2,2,4-triamino-5(2H)-oxazolona (Oz) (Fig. 1) em solução aquosa neutra, e a sua meia-vida é de 147 min em condições fisiológicas . Adicionalmente, 2-6 moléculas de Oz são detectadas por 107 bases de guanina no ADN do fígado, e foi recentemente demonstrado que a quantidade de Oz é significativamente aumentada na presença de 5-metilcitosina . Assim, a influência biológica de Oz na replicação do DNA é provavelmente maior do que a de Iz.
Klenow fragmento exo- incorpora adenina oposta a Oz in vitro , e Oz causa G:C-T:A transversões em E. coli . Em contraste, no nosso sistema de reacção in vitro, o fragmento de Klenow exo- incorpora ou adenina ou guanina oposta a Oz . Além disso, revelámos que as DNA polimerases α, β, δ, e ε cada uma incorpora apenas guanina oposta a Oz; DNA polimerases γ, κ, e Sulfolobus solfataricus DNA polimerase IV, além do fragmento de Klenow exo-, cada uma incorpora guanina e adenina; DNA polimerase η incorpora guanina, adenina e citosina; DNA polimerases ζ e ι cada uma incorpora guanina, adenina, citosina e timina; e REV1 incorpora citosina . Estas análises indicam que as DNA polimerases, excepto a REV1, incorporam a guanina oposta à Oz . Previmos que Oz pode formar um par de bases estável com guanina, e que este par de bases Oz:G tem duas ligações de hidrogénio e é planar (Fig. 3c) . Realizámos recentemente experiências de desnaturação térmica e comunicámos que o par de base Oz:G é mais estável termodinamicamente do que Oz:A, Oz:C, e Oz:T .
Além disso, as DNA polimerases α, β, γ, δ, ε, η, κ, e ζ alongam o primer a todo o comprimento em Oz . Assim, Oz parece ser uma lesão oxidada relacionada com a indução de transversos G:C-C:G. Em particular, a DNA polimerase ζ alonga-se para além de Oz com quase a mesma eficiência que para além de G , mas não para além do tetrahidrofurano (THF; um site análogo quimicamente estável abasic), 8-oxoG, ou O 6-metilguanina . Estes dados indicam que a DNA polimerase ζ é uma replicação eficaz de polimerase com tendência a erro para Oz. Além disso, apenas REV1 incorpora citosina oposta a Oz, e a frequência de inserção da citosina segue a ordem Oz > guanidinoidantoína (Gh) > THF > 8-oxoG . Dado que REV1 pode interagir com DNA polimerases , os resultados colectivos até à data sugerem que REV1 juntamente com DNA polimerase ζ pode prevenir transversos G:C-C:G . Tais sistemas para prevenir a mutação são observados noutras polimerases de ADN .
Reacção de oligonucleótidos contendo oz com enzimas de reparação
Células utilizam vários mecanismos para prevenir os efeitos mutagénicos dos tipos de danos no ADN acima descritos, e têm várias enzimas que reparam danos no ADN, tais como 8-oxoG .
E. coli formamidopirimidina DNA glicosilase e endonucleases III enzimas Oz de oligómeros de ADN de cadeia dupla . Além disso, as NTH1 e NEIL1 humanas, que são homólogos das E. coli endonucleases III e VIII, removem Oz tão eficazmente como removem 5-hidroxiuracil, e a sua reactividade em relação a Oz é superior à de 8-oxoG . Como Oz é mais sensível do que 8-oxoG ao tratamento com piperidina, esta diferença na reactividade depende da força da ligação N-glicosídica .
Analisamos as actividades de incisão de outras enzimas de reparação sobre Oz. O vírus Chlorella dimer glicosilase pirimidina, que exibe actividade de incisão em direcção ao dimer ciclobutano pirimidina, reage com ADN de cadeia dupla contendo Oz. A sua reactividade em relação a Oz é superior à de 8-oxoG, indicando que a reactividade depende da força de ligação N-glicosídica, semelhante à NEIL1 e NTH1 humana. Contudo, esta enzima de reparação apresenta uma actividade moderada em relação ao Oz, em comparação com a sua actividade em relação ao ciclobutano pyrimidine dimer .
Endonuclease IV, uma endonuclease apurínica/apyrimidínica, incisão de Oz com uma actividade observada de um terço a um quarto daquela em relação ao THF , mas com maior eficácia do que a sua actividade em relação ao Gh. Estes resultados sugerem que Oz pode ser mais estruturalmente semelhante a um sítio abásico do que Gh .
p>Andonuclease V, que exibe actividade para resíduos de hipoxantina, é também activa para Oz. Esta actividade é inferior à da hipoxantina em altas concentrações de endonuclease V, mas a endonuclease V reconhece Oz de forma muito mais eficiente do que a Gh. A endonuclease V pode reconhecer o uracil mas não a timina, sugerindo que o grupo 5′-methyl é crítico para o reconhecimento pela endonuclease V . Como descrito anteriormente, ao contrário da estrutura de anel fechado de Oz (Fig. 1), Gh tem uma moleza protuberante do anel, semelhante à timina. Assim, a endonuclease V pode reconhecer Oz mas não Gh.
Human OGG1 e AP endonuclease 1 não podem consumir resíduos de Oz , e a uracil-DNA glicosilase 1 monofuncional monofuncional não exibe qualquer actividade de incisão em direcção a Oz (dados não mostrados). E. coli Mut Y não pode actuar nas lesões de Oz:G e Oz:A (dados não mostrados). Oz é um substrato fraco para a reparação da excisão de nucleótidos humanos porque o local danificado é menos volumoso do que o dos fotoprodutos de pirimidina (6-4) pirimidona, tornando difícil para o XPC-RAD23B reconhecer Oz .
Os dados disponíveis até à data indicam que a NEIL1 e NTH1 humanas são as enzimas de reparação mais prováveis para Oz. Contudo, NEIL1, NTH1, E. coli endonucleases III humanas, e formamidopirimidina DNA glicosilase humana podem todas consumir Oz a partir de ADN de cadeia dupla, independentemente do tipo de base oposta a Oz . Se a base oposta a Oz for adenina, guanina, ou timina antes da reparação da excisão da base, a informação genética é alterada nas replicações subsequentes. Assim, pode haver enzimas desconhecidas que podem remover com precisão o Oz dos oligonucleótidos em que o Oz está emparelhado a um C, tal como o OGG1 humano pode remover 8-oxoG. Alternativamente, como mencionado anteriormente , a REV1-DNA polimerase ζ pode impedir as transversalidades G:C-C:G.
O OzOz obstrui a síntese de DNA por polimerases de DNA?
Guaninas contíguas (GG), que existem em muitas regiões genómicas importantes como o K-ras oncogene , são mais facilmente oxidadas do que uma única guanina devido ao seu potencial redox inferior . A oxidação das sequências de GG sob condições de alta oxidação resulta numa lesão contígua de guanina oxidada. Anteriormente relatámos que o IzIz é produzido pela oxidação do GG em ADN de cadeia simples e dupla, sugerindo que a hidrólise destas moléculas de Iz produz duas moléculas contíguas de Oz (OzOz). Espera-se que a síntese de ADN de OzOz cesse mais eficazmente do que um único Oz, representando assim danos de ADN mais graves do que um único Oz.
A nossa análise mostrou que a DNA polimerase κ não incorporou nenhum nucleótido oposto ao OzOz . O fragmento de Klenow exo- incorporou preferencialmente uma adenina oposta a 3′ Oz de lesões de OzOz, REV1 incorporou citosina, e DNA polimerase β incorporou guanina . DNA polimerase α incorporou guanina, adenina e citosina em frente às lesões de 3′ Oz de OzOz, e a guanina foi incorporada mais rapidamente do que a adenina e a citosina . A DNA polimerase ι incorporou ligeiramente a guanina, adenina e timina . Quer uma base seja incorporada ou não, estas polimerases não podem alongar o primário até ao comprimento total através do OzOz .
Em contraste, a DNA polimerase η alongou o primário até ao comprimento total através das lesões de OzOz com uma eficiência modesta em comparação com as lesões com ciclobutano pirimidina dimer, com a síntese da maioria dos fios de ADN a empatar no 3′ ou 5′ Oz de OzOz . Em contraste, a DNA polimerase ζ poderia alongar eficazmente o primário até ao comprimento total através do OzOz , sugerindo que a DNA polimerase ζ é uma enzima importante para a síntese da translação para além das moléculas de Oz, tanto únicas como contíguas. Além disso, a DNA polimerase ζ incorpora todos os nucleótidos opostos tanto a 3′ como a 5′ Oz e é uma polimerase de ADN com tendência a erro para OzOz.
Fotooxidação em ADN quadrupxo
Sequências ricas em guanina como os telómeros podem dobrar-se em estruturas quadruplex. No ADN de cadeia dupla, a oxidação de um electrão de guanina em sequências contíguas de guanina depende da localização do orbital molecular mais ocupado (HOMO) . Ao contrário do ADN de cadeia dupla, a 3′-guanina do d(TGGGGT) é principalmente oxidada em ADN quádruplo, e a HOMO estimada está localizada na 3′-guanina (Fig. 4b). Dado o nosso entendimento actual do ADN de dupla cadeia e do ADN quadruplex , a oxidação selectiva de um electrão da guanina ocorre no HOMO localizado, independentemente da estrutura do ADN.
O equilíbrio proposto e HOMO de d(TGGGGGT)4. a Modelos de G-quadruplexes empilhados. Os planos azuis são guanina, e as bolas vermelhas são K+. b A localização do HOMO. Os HOMO foram calculados aos níveis B3LYP/6-31G* . Estes números são adaptados a partir de dados reportados anteriormente
Por outro lado, os produtos de oxidação da guanina dependem da estrutura do ADN. Por exemplo, o Iz é um produto importante no ADN de cadeia única, enquanto 8-oxoG e desidroguanidinoidantoína (Ghox) são formados principalmente em ADN quádruplolex. Iz, 8-oxoG, Ghox e Gh são formados em ADN de corda dupla, e são também importantes produtos de oxidação encontrados em ADN de corda simples e quadruplex .
O mecanismo de oxidação da guanina em ADN de corda simples, de corda dupla, e quadruplex pode ser explicado como se segue. A oxidação de um electrão de guanina gera um catião radical guanino (G-+) , seguido de duas vias de degradação (Fig. 5). Numa das vias, G-+ é desprotonado na posição N1, seguido de geração de Iz. Num outro caminho, G-+ é hidratado e desprotonado, seguido pela geração de 8-oxoG, Ghox, e Gh. Existe uma ligação de hidrogénio entre o protão N1 de G-+ e o O6 de guanina em ADN quadrupxo (Fig. 6a), e forma-se uma ligação de hidrogénio entre o protão N1 de G-+ e o N3 de citosina em ADN de dupla cadeia (Fig. 6b). Portanto, a desprotonificação de G-+ é significativamente inibida no DNA quadruplexo e parcialmente inibida no DNA de dupla corda. Estimamos a facilidade da desprotonação para seguir a ordem: ADN de corda única > DNA de corda dupla > ADN quadrupxo, e esta ordem explica as diferenças dos produtos de oxidação em cada tipo de estrutura de ADN.
Duas vias para a oxidação de guanine
