A pesquisa ainda estava em curso nos anos 30 para encontrar uma forma de usar tanto a luz directa como a luz difratada de todos os azimutes para produzir boas imagens de contraste de objectos não manchados que não absorvem a luz. A pesquisa de Frits Zernike durante este período revelou diferenças de fase e amplitude entre a ordem zeroth e a luz desviada que podem ser alteradas para produzir condições favoráveis à interferência e à melhoria do contraste.

Espécimes não retidos que não absorvem luz são chamados objectos de fase porque alteram ligeiramente a fase da luz difratada pelo espécime, geralmente retardando essa luz aproximadamente 1/4 de comprimento de onda em comparação com a luz directa não revelada que passa através ou em redor do espécime não afectado. Infelizmente, os nossos olhos, bem como o filme da câmara, não conseguem detectar estas diferenças de fase. Para reiterar, o olho humano é sensível apenas às cores do espectro visível (variações na frequência da luz) ou a diferentes níveis de intensidade da luz (variações na amplitude de onda).

Em amostras de fase, a luz de ordem zeroth directa passa através ou em redor da amostra não afectada. No entanto, a luz difratada pela amostra não é reduzida em amplitude como num objecto que absorve a luz, mas é abrandada pela amostra devido ao índice de refracção ou espessura da amostra (ou ambos). Esta luz difratada, atrasada em aproximadamente 1/4 de comprimento de onda, chega ao plano de imagem fora de fase (também denominada fora de fase) com a luz não revelada mas, em interferência, essencialmente não diminuída em intensidade. O resultado é que a imagem ao nível da ocular é tão pouco contrastante que torna os detalhes quase invisíveis.

Zernike conseguiu conceber um método – agora conhecido como microscopia de contraste de fase – para fazer objectos de fase não manchados, produzem imagens de contraste como se fossem objectos de amplitude. Os objectos de amplitude mostram um excelente contraste quando a luz difratada e directa está fora de fase (mostram uma diferença de fase) por 1/2 de um comprimento de onda. O método de Zernike era acelerar a luz directa em 1/4 do comprimento de onda de modo a que a diferença de comprimento de onda entre a luz directa e a luz desviada para uma amostra de fase fosse agora 1/2 do comprimento de onda. Como resultado, a luz directa e difratada que chegava ao nível da imagem da ocular seria capaz de produzir interferência destrutiva (ver a secção sobre formação da imagem para absorver objectos previamente descritos). Tal procedimento faz com que os detalhes da imagem pareçam mais escuros contra um fundo mais claro. A isto chama-se contraste de fase escura ou positiva. Uma ilustração esquemática da configuração básica do microscópio de contraste de fase é ilustrada na Figura 1.

Outra via possível, muito menos utilizada, é arranjar para abrandar a luz directa em 1/4 de comprimento de onda, para que a luz difratada e a luz directa cheguem à ocular em passo e possam interferir construtivamente. Esta disposição resulta numa imagem brilhante dos detalhes da amostra sobre um fundo mais escuro, e chama-se contraste negativo ou brilhante.

microscopia de contraste de fase foi muito bem sucedida e acabou por ganhar uma aplicação generalizada, resultando na atribuição por Zernike do prestigioso Prémio Nobel da Física em 1953. A técnica de contraste de fase foi aclamada como o maior avanço em microscopia num século. O contraste de fase, ao “converter” espécimes de fase como material vivo em espécimes de amplitude, permitiu aos cientistas ver detalhes em objectos não manchados e/ou vivos com uma clareza e resolução nunca antes alcançada.

O método Zernike envolve a separação da luz de ordem directa de zeroth da luz difratada no plano focal posterior do objectivo. Para tal, é colocado um anel anular em posição directamente sob a lente inferior do condensador no plano focal frontal do condensador, conjugado com o plano focal posterior da objectiva. Como o cone oco de luz do anel passa através do espécime sem ser desviado, chega ao plano focal posterior da objectiva sob a forma de um anel de luz. A luz mais fraca difratada pelo espécime é espalhada por todo o plano focal posterior da objectiva.

Se esta combinação fosse permitida, tal como está, para prosseguir para o plano da imagem da ocular, a luz difratada seria aproximadamente 1/4 de comprimento de onda atrás da luz directa. No plano da imagem, a fase da luz difratada estaria fora de fase com a luz directa, mas a amplitude da sua interferência seria quase a mesma que a da luz directa. Isto resultaria em muito pouco contraste de amostra.

Para acelerar a luz directa de ordem zeroth, uma placa de fase é instalada com um deslocamento de fase em forma de anel ligado ao mesmo no plano focal posterior do objectivo. A área estreita da placa de fase é opticamente mais fina do que o resto da placa. Como resultado, a luz não desviada que passa pelo anel de fase percorre uma distância mais curta ao atravessar o vidro da objectiva do que a luz difratada.

Agora, quando a luz directa não desviada e a luz difratada avançam para o plano da imagem, estão 1/2 comprimento de onda fora de fase uma com a outra. A luz difratada e directa pode agora interferir destrutivamente para que os detalhes do espécime pareçam escuros contra um fundo mais claro (tal como fazem para um espécime absorvente ou de amplitude). Esta é uma descrição do que ocorre em contraste de fase positivo ou escuro.

Se a área do anel de mudança de fase da placa de fase fosse mais espessa do que o resto da placa, a luz directa é diminuída em 1/4 de comprimento de onda. Neste caso, a luz de ordem zeroth chega ao plano da imagem em passo (ou em fase) com a luz difratada, e ocorre uma interferência construtiva. A imagem parece brilhante sobre um fundo mais escuro. A imagem aparece brilhante sobre um fundo mais escuro. Este tipo de contraste de fase é descrito como contraste negativo ou brilhante.

Porque a luz não revelada da ordem zeroth é muito mais brilhante do que a luz difratada fraca, uma fina camada metálica transparente de absorção é depositada sobre o anel para trazer a luz directa e difratada para um melhor equilíbrio de intensidade a fim de aumentar o contraste. Além disso, como a aceleração ou desaceleração da luz directa é calculada num comprimento de onda de 1/4 de luz verde, a imagem de fase aparecerá melhor quando for colocado um filtro verde no caminho da luz (é preferível um filtro de interferência verde). Tal filtro verde também ajuda os objectivos acromáticos a produzir as suas melhores imagens, uma vez que os acromatos são corrigidos esféricamente para luz verde.

Os acessórios necessários para trabalhos de contraste de fase são um condensador de contraste de fase de subestágio equipado com anel e um conjunto de objectivos de contraste de fase, cada um dos quais com uma placa de fase instalada. O condensador tem normalmente uma posição de campo brilhante com um diafragma de abertura e uma torre rotativa de anéis (cada objectivo de fase de ampliação diferente requer um anel de diâmetro crescente à medida que a ampliação da objectiva aumenta). Cada objectiva de fase tem um anel escurecido na sua lente posterior. Tais objectivas também podem ser usadas para trabalhos de luz transmitidos de campo claro normal com apenas uma ligeira redução na qualidade de imagem.

O equipamento de fase, tal como fornecido pelo fabricante, inclui normalmente um filtro verde e um telescópio de fase. Este último é utilizado para permitir ao microscopista acender o anel do condensador para o sobrepor ao anel da placa de fase. Um conjunto de parafusos centradores no condensador de subestágio permite a manipulação do anel para o alinhar enquanto se observa o plano focal posterior da objectiva com o telescópio de fase (ou através de uma lente Bertrand).

Para montar um microscópio de fase (as células de revestimento das bochechas são um material de teste prontamente disponível), focalizar a amostra com a objectiva de fase 10X. A seguir, configurar o microscópio para iluminação Köhler utilizando a posição de campo brilhante (0) do condensador. Este passo crítico é assegurar o alinhamento adequado da objectiva, condensador e diafragma de campo do microscópio. Depois do microscópio estar devidamente alinhado, abrir o diafragma de abertura do condensador e colocar a torre do condensador na posição 10 (isto normalmente abre automaticamente o diafragma de abertura). Colocar o filtro verde no caminho da luz, e remover uma das oculares. Insira o telescópio de fase e, enquanto observa a parte de trás da objectiva, utilize os parafusos de centragem do anel para centrar o anel no anel da placa. Uma lente Bertrand ou uma ocular de orifício, se disponível, permitirá uma visão do plano focal posterior da objectiva. A centragem do anel de fase é muitas vezes mais fácil de fazer se o espécime for temporariamente removido do caminho da luz. Após o alinhamento do anel de fase com o anel, reintroduzir a ocular e colocar a amostra de volta no seu devido lugar na fase de microscópio no percurso óptico.

Repetir o mesmo procedimento para cada objectiva, certificando-se de que a torre é rodada de modo a que o anel de fase apropriado seja posicionado de modo a corresponder à ampliação da objectiva. Alguns fabricantes fornecem ânulos individuais de encaixe, centrados, que podem ser inseridos na parte inferior do condensador comum da Abbe. Estes dispositivos simples e baratos dão-se bem com os objectivos de fase 10X, 20X e 40X, mas o condensador pode receber apenas um de cada vez.

O microscópio de fase continua a ser uma ferramenta amplamente utilizada e importante, particularmente para o microscopista que estuda material vivo e/ou não manchado, tais como células e tecidos em cultura. O método é também utilizado actualmente em simultâneo com a fluorescência de luz reflectida para revelar áreas de um espécime que não fluorescem. As técnicas de microscopia de fase são particularmente úteis com amostras que são finas e dispersas no campo de visão.

Existem algumas limitações da microscopia de contraste de fase:

• As imagens de fase são normalmente rodeadas por halos em torno dos contornos dos detalhes. Tais halos são artefactos ópticos, que por vezes obscurecem os limites dos detalhes.
• A fase anula a abertura numérica de trabalho do sistema óptico até um certo grau, reduzindo assim a resolução.
• Contraste de fase não funciona bem com espécimes espessos devido a mudanças de fase que ocorrem a partir de áreas ligeiramente abaixo ou ligeiramente acima do plano que está em foco. Tais deslocamentos de fase confundem a imagem e distorcem o detalhe da imagem.
• As imagens fase aparecem cinzentas se for utilizada luz branca e verdes se for utilizado um filtro verde. No passado, muitos microscopistas restringiram o seu filme ao preto e branco quando realizavam fotomicrografia em amostras de fase. Hoje em dia, muitos filmes a cores reproduzem preto, branco e cinzento de forma muito eficaz, especialmente as películas de transparência equilibradas com tungsténio de Fuji, Kodak, e Agfa.

Microscopia de fase é outro exemplo de como a manipulação da luz ao nível da lente inferior do condensador de subestágio e ao nível do plano focal posterior da objectiva tem um efeito significativo na imagem que é observada através da ocular.