Il DNA ricombinante (o rDNA) si ottiene combinando il DNA di due o più fonti. In pratica, il processo comporta spesso la combinazione del DNA di diversi organismi. Il processo dipende dalla capacità di tagliare e riunire le molecole di DNA in punti che sono identificati da specifiche sequenze di basi nucleotidiche chiamate siti di restrizione. I frammenti di DNA sono tagliati fuori dalla loro posizione normale nel cromosoma usando enzimi di restrizione (chiamati anche endonucleasi di restrizione) e poi inseriti in altri cromosomi o molecole di DNA usando enzimi chiamati ligasi.

Clonazione genica

Questo descrive il processo di copiare frammenti di DNA che possono poi essere usati per molti scopi diversi, come la creazione di colture GM, o trovare una cura per le malattie. Ci sono due tipi di clonazione genica: in vivo, che comporta l’uso di enzimi di restrizione e ligasi utilizzando vettori e clonando i frammenti in cellule ospiti (come si può vedere nell’immagine sopra). L’altro tipo è in vitro che utilizza il metodo della reazione a catena della polimerasi (PCR) per creare copie di frammenti di DNA.

Per la clonazione in vivo un frammento di DNA, contenente un singolo gene o un numero di geni, viene inserito in un vettore che può essere amplificato all’interno di un’altra cellula ospite. Un vettore è una sezione di DNA che può incorporare un altro frammento di DNA senza perdere la capacità di auto-replicazione, e un vettore contenente un frammento di DNA aggiuntivo è noto come vettore ibrido. Se il frammento di DNA include uno o più geni, il processo viene definito clonazione genica.

Clonazione del DNA nei plasmidi

Contribuente: Genome Management Information System, Oak Ridge National Laboratory, U.S. Department of Energy Genome Programs http://genomics.energy.gov

Ci sono 4 diversi tipi di vettori:

• Vettori plasmidici
• Vettori fagi Lamda (λ)
• Cosmidi
• Vettori di espressione

La cellula ospite copia il DNA clonato usando i propri meccanismi di replicazione. Una varietà di tipi di cellule sono usate come ospiti, inclusi batteri, cellule di lievito e cellule di mammifero.

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

Fonte: Andy Vierstraete

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

Questo è un metodo in vitro per fare molte copie di una sezione specifica di DNA, senza bisogno di vettori o cellule ospiti. Il DNA da copiare – il DNA modello – è mescolato con primer forward e reverse complementari all’estremità del DNA modello, nucleotidi, e una versione di DNA polimerasi nota come Taq polimerasi. (Questo enzima è stabile alle alte temperature ed è ottenuto dal batterio termofilo Thermus aquaticus). Il processo comporta la ripetizione di tre passi:

• denaturazione, che separa i due filamenti nucleotidici della molecola di DNA
• ricottura del primer, in cui i primer si legano al DNA a singolo filamento
• estensione, in cui i nucleotidi vengono aggiunti ai primer – in direzione 5′ a 3′ – per formare una copia a doppio filamento del DNA target.

Ogni ciclo richiede pochi minuti, e cicli ripetuti possono produrre grandi quantità di una specifica sequenza di DNA in poche ore piuttosto che in giorni. Tuttavia, questo metodo di clonazione richiede la conoscenza di alcuni dettagli sulla sequenza nucleotidica da copiare, e la tecnica è molto sensibile a piccole quantità di contaminazione.

Biblioteche genetiche

Fonte: http://www.emunix.emich.edu/~rwinning/genetics/index.htm

Una biblioteca genica è una grande collezione di sequenze di DNA clonate da un singolo genoma. Una biblioteca genomica, (come si può vedere sopra) in teoria, conterrebbe almeno una copia di ogni sequenza nel genoma di un organismo. Queste sono usate per studiare la struttura di un dato cromosoma, o per clonare geni specifici. Questi tipi di librerie possono essere preparati da un sottoinsieme dell’intero genoma (per esempio, un singolo cromosoma). Il primo passo nella creazione di una biblioteca genomica è quello di rompere, o “frazionare”, il genoma usando metodi fisici o enzimi di restrizione. I frammenti vengono poi collegati a vettori appropriati e clonati in una popolazione cellulare ospite adatta.

Una biblioteca cDNA (DNA complementare) contiene il DNA presente in una data popolazione cellulare che viene preparato dall’mRNA (RNA messaggero) utilizzando l’enzima trascrittasi inversa. Il cDNA risultante rappresenta i geni espressi nella popolazione cellulare come sottoinsieme dell’intero genoma, e può essere clonato usando un vettore e una cellula ospite adatta (come si vede nello schema qui sopra). Il cDNA non includerà introni o sequenze di regolazione perché questi vengono rimossi dall’RNA durante l’elaborazione, e questo rende una libreria di cDNA più facile da mantenere. Una libreria di cDNA può anche essere preparata usando la PCR con trascrittasi inversa (RT-PCR).

L’identificazione dei prodotti genici in una libreria genica

Gli enzimi di restrizione (per tagliare il DNA) e l’elettroforesi su gel (per separare i frammenti risultanti) possono essere usati per produrre una mappa fisica dei segmenti di DNA in un processo noto come mappatura di restrizione. Un esempio di come può apparire uno di questi può essere visto qui sotto.

Fonte: Università di Leicester

Ci sono anche una serie di tecniche che possono essere utilizzate per identificare specifici geni o prodotti genici all’interno di una libreria genica e questi sono: Southern blotting, Northern blotting e Western blotting. Tuttavia, la tecnica sperimentale più potente per indagare la genetica a livello molecolare è il sequenziamento del DNA, che permette di determinare le sequenze nucleotidiche dei geni – anche di interi cromosomi. Le tecnologie di sequenziamento automatizzato ci permettono ora di sequenziare gli interi genomi di organismi, dai batteri agli esseri umani.

Genetica molecolare e biotecnologia

Le nuove tecniche di genetica molecolare, combinate con gli sviluppi delle biotecnologie associate, hanno portato a progressi in diversi campi. Ora possiamo analizzare i genomi di specie che danno un importante contributo all’agricoltura, alla produzione di carburante o allo sviluppo di farmaci. Possiamo spostare geni specifici da un organismo all’altro per creare piante e animali transgenici, e usare tecniche di clonazione animale per produrre animali geneticamente identici, come la pecora Dolly, e più recentemente, animali domestici clonati come cani e gatti.

Il processo di clonazione è semplice, ma i risultati non sono sempre prevedibili. Ci sono volute molte centinaia di tentativi per farlo funzionare e produrre una sola pecora viva, e la clonazione in sé solleva molte domande non solo sui benefici e sui rischi, ma anche molte questioni etiche.

Diagramma di maiali per mostrare come viene effettuata la clonazione animale. Fonte: National Human Genome Research Institute

La tecnica del fingerprinting genetico, che permette di identificare gli individui e le relazioni tra gli individui, ha trovato oggi molte applicazioni nella scienza. C’è anche una ricerca in corso sulla terapia genica che esamina la possibilità di introdurre geni clonati per compensare i geni difettosi e mutanti. E altre aree, per esempio la clonazione umana e la ricerca sulle cellule staminali aprono molte questioni etiche che devono essere affrontate insieme agli sviluppi scientifici.

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