RISULTATI E DISCUSSIONE
Per clonare il gene della miostatina di altre specie, sono state costruite librerie di cDNA dall’RNA isolato dal tessuto muscolare scheletrico e sono state esaminate con una sonda per la miostatina del topo corrispondente alla regione C-terminale conservata, che è la parte matura e attiva della molecola. Un allineamento delle sequenze previste di aminoacidi di miostatina murina, russa, umana, babbuina, bovina, suina, ovina, di pollo, di tacchino e di pesce zebra, dedotte dall’analisi della sequenza nucleotidica dei cloni di cDNA a lunghezza intera, è mostrato in Fig. 1. Tutte queste sequenze contengono una sequenza di segnale putativo per la secrezione e un sito putativo di elaborazione proteolitica RXXR (aminoacidi 263-266) seguito da una regione contenente i residui conservati di cisteina C-terminale trovati in tutti i membri della famiglia del fattore di crescita trasformante β (1). Come si vede da questo allineamento, la miostatina è altamente conservata tra le specie. Infatti, le sequenze di miostatina murina, di ratto, umana, suina, di pollo e di tacchino sono identiche al 100% nella regione C-terminale che segue il sito putativo di elaborazione proteolitica, e la miostatina di babbuino, bovino e ovino contiene solo da uno a tre aminoacidi di differenza nella proteina matura. La miostatina di zebrafish è considerevolmente più divergente ed è solo 88% identica alle altre in questa regione.
Allineamento della sequenza di aminoacidi della miostatina murina, russa, umana, babbuina, bovina, suina, ovina, di pollo, di tacchino, e del pesce zebra. I residui ombreggiati indicano gli aminoacidi che corrispondono al consenso. Gli aminoacidi sono numerati rispetto alla sequenza umana. Le linee tratteggiate indicano le lacune.
L’alto grado di conservazione della sequenza della miostatina attraverso le specie suggerisce che anche la funzione della miostatina è stata conservata. Per determinare se la miostatina gioca un ruolo nella regolazione della massa muscolare in animali diversi dal topo, abbiamo studiato la possibilità che mutazioni nel gene della miostatina possano spiegare l’aumento della massa muscolare osservato nelle razze di bestiame a doppia muscolatura. La doppia muscolatura, che è stata osservata in molte razze di bestiame negli ultimi 190 anni, sembra essere ereditata come un singolo locus autosomico principale con diversi modificatori dell’espressione fenotipica, con conseguente penetranza incompleta (7). Nella razza bovina a doppia muscolatura più ampiamente studiata, il Blu Belga, il fenotipo della doppia muscolatura (Fig. 2) segrega come un singolo locus genetico designato ipertrofia muscolare (mh) (8). La mutazione mh, che è parzialmente recessiva, causa un aumento medio della massa muscolare del 20-25%, una diminuzione della massa della maggior parte degli altri organi (9, 10), e una diminuzione del grasso intramuscolare e del tessuto connettivo (11). Il locus mh è strettamente legato a marcatori su una regione del cromosoma 2 bovino (12) che è sintenica a una regione del cromosoma 2 umano (2q32) (13) in cui avevamo mappato il gene della miostatina umana mediante ibridazione in situ a fluorescenza (dati non mostrati).
Un toro belga blu purosangue che mostra il fenotipo della doppia muscolatura.
Le somiglianze nel fenotipo tra i topi privi di miostatina e la razza bovina belga blu e le posizioni simili della mappa del gene della miostatina e del locus mh hanno suggerito l’omologo bovino della miostatina come gene candidato per il locus mh. Per determinare se il gene della miostatina bovina è mutato nella razza blu belga, tutti e tre gli esoni del gene del toro blu belga a sangue pieno mostrato in Fig. 2 sono stati amplificati mediante PCR, subclonati e sequenziati. La sequenza codificante della miostatina blu belga era identica a quella della Holstein, tranne che per una delezione dei nucleotidi 937-947 nel terzo esone (Fig. 3). Questa delezione di 11 nucleotidi causa un frame-shift che si prevede risulterà in una proteina troncata che termina 14 codoni a valle del sito della mutazione. La delezione dovrebbe essere una mutazione nulla perché si verifica solo dopo i primi 7 aminoacidi della regione C-terminale, con conseguente perdita di 102 aminoacidi (aminoacidi 274-375). Questa mutazione è simile alla mutazione mirata nei topi null myostatin in cui l’intera regione che codifica la proteina matura è stata eliminata (2). Tramite analisi Southern blot, utilizzando oligonucleotidi corrispondenti alla sequenza wild-type o mutante, questa mutazione è stata trovata in entrambi gli alleli in 14/14 bovini Belgian Blue a sangue intero esaminati (dati non mostrati).
Mutazioni della miostatina nei bovini Belgian Blue (sinistra) e Piemontesi (destra) rispetto ai bovini Holstein wild-type. I nucleotidi immediatamente precedenti (A936) e successivi (C948) alla delezione di 11 nucleotidi del Belgian Blue sono contrassegnati. Le sequenze nucleotidiche e aminoacidiche sono riportate di seguito e numerate rispetto al wild type. La delezione di 11 nucleotidi Belgian Blue (Δ937-947) è inscatolata, e la transizione G1056A piemontese è contrassegnata. Le lettere in grassetto indicano i cambiamenti nucleotidici e aminoacidici. Le frecce identificano le posizioni delle mutazioni nella sequenza codificante della miostatina. L’ombreggiatura indica la sequenza del segnale (grigio), la regione pro (bianco) e la regione matura C-terminale (nero).
Abbiamo anche sequenziato il gene della miostatina in un’altra razza bovina, la Piemontese, in cui la doppia muscolatura si verifica con una frequenza estremamente elevata (4). La sequenza della Piemontese conteneva 2 cambiamenti nucleotidici rispetto alla sequenza della Holstein. Uno era una trasversione da C ad A nell’esone 1, con conseguente sostituzione conservativa della leucina con la fenilalanina (aminoacido 94). La seconda era una transizione da G ad A nell’esone 3, con conseguente sostituzione della cisteina con la tirosina nella regione matura della proteina (aminoacido 313) (Fig. 3). Con l’analisi Southern blot, questa mutazione è stata trovata in entrambi gli alleli in 10/10 bovini piemontesi a doppio muscolo esaminati. È probabile che questa mutazione comporti una perdita completa o quasi completa della funzione, poiché questo residuo di cisteina è invariante non solo tra tutte le sequenze di miostatina ma anche tra tutti i membri noti della superfamiglia del fattore di crescita trasformante β (1). Questo residuo di cisteina è noto per essere uno degli amminoacidi coinvolti nella formazione della struttura intramolecolare del nodo di cistina nei membri di questa superfamiglia di cui si conosce la struttura tridimensionale (14-17). Inoltre, quando la cisteina corrispondente nell’attivina A (cisteina-44) è stata mutata in alanina, la proteina mutante aveva solo il 2% del legame al recettore wild-type e dell’attività biologica (18).
Le posizioni simili della mappa del gene della miostatina e del locus mh e l’identificazione di mutazioni relativamente gravi nel gene della miostatina di due diverse razze di bovini a doppia muscolatura suggeriscono che queste mutazioni sono responsabili del fenotipo della doppia muscolatura. Per supportare ulteriormente questa ipotesi, abbiamo analizzato il DNA isolato da 120 singoli bovini purosangue o purosangue di altre 16 razze che non sono classificate come doppio muscolo (11 Angus, 11 Charolais, 10 Holstein, 10 Brown Swiss, 10 Polled Hereford, 10 Gelbvieh, 9 Simmental, 9 Jersey, 9 Guernsey, 9 Ayrshire, 7 Limousin, 4 Brahman, 4 Polled Shorthorn, 4 Red Angus, 2 Chianina e 1 Texas Longhorn) per la presenza di ciascuna di queste mutazioni (Fig. 4). Con l’analisi Southern blot, la sostituzione da cisteina a tirosina presente nella razza Piemontese non è stata rilevata in nessuno dei 120 individui. La delezione di 11 nucleotidi presente nella razza Blu Belga è stata rilevata in un allele di un singolo toro purosangue Red Angus non a doppio muscolo. A questo proposito, è stato suggerito che il fenotipo a doppia muscolatura che si osserva occasionalmente in molte razze può essere dovuto a una singola mutazione o a pochissime mutazioni che sono migrate in molte delle razze bovine europee durante lo sviluppo delle razze moderne (7). I nostri risultati dimostrano che le mutazioni della miostatina che causano la doppia muscolatura si sono verificate almeno due volte nei bovini.
Ibridizzazione Southern blot rappresentativa che mostra la presenza delle sequenze mutanti del Blu Belga e del Piemontese solo nelle razze bovine a doppia muscolatura. I prodotti PCR dell’esone 3 sono stati ibridati a sonde oligonucleotidiche che abbracciano la sequenza wild-type della regione della mutazione Belgian Blue (riga superiore), la mutazione Belgian Blue Δ937-947 (seconda riga), la sequenza wild-type al nucleotide 1.056 (terza riga), e la sequenza mutante Piemontese al nucleotide 1.056 (riga inferiore). Le differenze di intensità della banda riflettono le differenze nelle quantità di prodotti di PCR caricati, come giudicato da colorazione bromuro di etidio (dati non mostrati). L’omozigosi per le mutazioni è stata vista solo nel bestiame con doppio muscolo e non in nessun bestiame convenzionale come descritto nel testo (P < 0.001 da χ2).
Infine, per escludere la presenza di altre mutazioni della miostatina in razze non doppie, abbiamo determinato la sequenza completa della regione codificante della miostatina di 11 di queste razze (Angus, Charolais, Brown Swiss, Polled Hereford, Gelbvieh, Guernsey, Ayrshire, Limousin, Brahman, Polled Shorthorn, e Texas Longhorn). Questa analisi ha rivelato solo polimorfismi che erano cambiamenti silenziosi nelle sequenze codificanti o erano presenti negli introni e nelle regioni non tradotte.
A differenza dei topi, una mutazione null della miostatina nei bovini causa una riduzione delle dimensioni degli organi interni e solo un modesto aumento della massa muscolare (20-25% nella razza Belgian Blue rispetto al 200-300% nei topi con deficit di miostatina). È possibile che i bovini siano più vicini a un limite massimo di dimensioni muscolari dopo generazioni di allevamento selettivo per una grande massa muscolare, a differenza dei topi, che non sono stati selezionati in modo simile. A questo proposito, anche nelle razze bovine che non sono fortemente muscolose, la sequenza della miostatina contiene due differenze amminoacidiche adiacenti non conservative (EG contro KE) nella regione C-terminale, rispetto a tutte le altre specie esaminate. Anche se il significato funzionale di queste differenze è sconosciuto, è possibile che questi due cambiamenti rappresentino un allele parziale di perdita di funzione che si è fissato nella popolazione durante molti anni di allevamento del bestiame.
Per le applicazioni agricole, ci sono alcuni svantaggi per il bestiame a doppia muscolatura, vale a dire la riduzione della fertilità femminile, una minore vitalità della prole e un ritardo nella maturazione sessuale (19). Tuttavia, nella razza blu belga, l’aumento della massa muscolare e la maggiore efficienza alimentare compensano ampiamente questi svantaggi (20). Il fatto che una mutazione nulla nel gene della miostatina nei bovini si traduca in animali ancora vitali e fertili e che producono carne di alta qualità dimostra il valore potenziale di produrre un aumento della massa muscolare in altri animali da carne come pecore, maiali, polli, tacchini e pesci interrompendo la funzione della miostatina. Infatti, l’alto grado di conservazione delle sequenze in animali che vanno dai mammiferi agli uccelli ai pesci suggerisce che la funzione biologica della miostatina è stata conservata ampiamente in tutto il regno animale.