Il DNA cellulare è costantemente ossidato da vari agenti endogeni ed esogeni, e il danno al DNA risultante può aumentare il rischio di sviluppare il cancro e altre malattie. La guanina ha il più basso potenziale redox delle quattro basi del DNA ed è quindi la più facilmente ossidabile.

Durante la replicazione del DNA, l’incorporazione dell’adenina di fronte ad un prodotto di ossidazione della guanina induce una trasversione G:C-T:A, mentre l’incorporazione della guanina di fronte ad un prodotto di ossidazione della guanina causa una trasversione G:C-C:G. Queste mutazioni (vedi riferimenti in ) si trovano in molti geni importanti, e in particolare nei siti CpG nel gene soppressore del tumore p53 e nei codoni 12 e 13 dell’oncogene K-ras. Pertanto, è importante analizzare l’incorporazione del nucleotide e l’estensione del DNA per ogni prodotto di ossidazione della guanina al fine di chiarire i meccanismi alla base della generazione di trasversioni G:C-T:A e G:C-C:G.

8-Oxo-7,8-diidroguanina (8-oxoG) (Fig. 1) è una delle più comuni lesioni ossidative del DNA e si forma in varie condizioni ossidative. L’8-OxoG è stato ampiamente studiato, ha un impatto biologico significativo ed è un marcatore ubiquitario del DNA ossidativamente danneggiato. Le analisi strutturali hanno rivelato che 8-oxoG adotta una conformazione anti o syn: 8-oxoG nella conformazione anti forma coppie di basi Watson-Crick con la citosina, mentre la lesione nella conformazione syn utilizza il bordo Hoogsteen della lesione per formare una coppia di basi con l’adenina (Fig. 2). Inoltre, le DNA polimerasi incorporano l’adenina oltre alla citosina di fronte a 8-oxoG , e 8-oxoG induce una trasversione G:C-T:A in Escherichia coli (E. coli) e nelle cellule di mammifero.

Anche se 8-oxoG causa trasversioni G:C-T:A, il meccanismo alla base della generazione di trasversioni G:C-C:G non può essere spiegato da 8-oxoG. Inoltre, l’8-oxoG è ossidato più facilmente della guanina a causa del suo potenziale di ossidazione inferiore, e quindi varie lesioni ossidative sono prodotte dall’ossidazione dell’8-oxoG. Pertanto, è necessario studiare sia 8-oxoG che altre lesioni ossidate della guanina per capire i vari fenomeni causati dall’ossidazione della guanina.

I prodotti di ossidazione della guanina che causano le trasversioni G:C-C:G formano coppie di basi mediante legame a idrogeno con la guanina

Come già detto, la trasversione G:C-C:G è causata dall’incorporazione della guanina opposta a un prodotto di ossidazione della guanina. In questa sezione descriviamo prima la “regola A”. L’adenina è la base più comunemente incorporata di fronte a un sito abasico dalle DNA polimerasi, suggerendo che, delle quattro basi naturali, l’adenina forma le interazioni più idrofobiche e presenta la migliore compatibilità spaziale con un sito abasico. L’incorporazione dell’adenina potrebbe non richiedere necessariamente la formazione di legami idrogeno con vari siti di DNA danneggiati nel DNA modello. Al contrario, l’inserimento preferenziale della guanina richiede la formazione di legami a idrogeno, oltre alle interazioni idrofobiche e alla compatibilità spaziale, con la base del template. Quindi, al fine di rivelare le lesioni che causano le trasversioni G:C-C:G, è importante studiare i prodotti di ossidazione della guanina che formano coppie di basi mediante legame a idrogeno con la guanina.

Potenziali prodotti di ossidazione della guanina che causano trasversioni G:C-C:G

Iz viene lentamente idrolizzato a 2,2,4-triamino-5(2H)-oxazolone (Oz) (Fig. 1) in soluzione acquosa neutra, e la sua emivita è di 147 minuti in condizioni fisiologiche. Inoltre, 2-6 molecole di Oz sono rilevate per 107 basi di guanina nel DNA del fegato, ed è stato recentemente dimostrato che la quantità di Oz è significativamente aumentata in presenza di 5-metilcitosina. Quindi, l’influenza biologica di Oz nella replicazione del DNA è probabilmente più grande di quella di Iz.

Klenow frammento exo- incorpora adenina opposta Oz in vitro, e Oz provoca G:C-T:A trasversioni in E. coli . Al contrario, nel nostro sistema di reazione in vitro, Klenow frammento exo- incorpora sia adenina o guanina opposta Oz. Inoltre, abbiamo rivelato che le DNA polimerasi α, β, δ, e ε ciascuno incorporano solo guanina opposta Oz; DNA polimerasi γ, κ, e Sulfolobus solfataricus DNA polimerasi IV, oltre al frammento Klenow exo-, ciascuno incorpora guanina e adenina; DNA polimerasi η incorpora guanina, adenina e citosina; DNA polimerasi ζ e ι ciascuno incorporano guanina, adenina, citosina e timina; e REV1 incorpora citosina . Queste analisi indicano che le DNA polimerasi, tranne REV1, incorporano guanina di fronte a Oz. Abbiamo previsto che Oz può formare una coppia di basi stabile con la guanina, e che questa coppia di basi Oz:G ha due legami idrogeno ed è planare (Fig. 3c). Abbiamo recentemente eseguito esperimenti di denaturazione termica e riportato che la coppia di basi Oz:G è più termodinamicamente stabile di Oz:A, Oz:C, e Oz:T.

Inoltre, le DNA polimerasi α, β, γ, δ, ε, η, κ, e ζ allungano ciascuno il primer a lunghezza completa attraverso Oz. Così, Oz sembra essere una lesione ossidata legata all’induzione delle trasversioni G:C-C:G. In particolare, la DNA polimerasi ζ allunga oltre Oz con quasi la stessa efficienza che oltre G, ma non oltre il tetraidrofurano (THF; un analogo del sito abasico chimicamente stabile), 8-oxoG, o O 6-metilguanina. Questi dati indicano che la DNA polimerasi ζ è un’efficace polimerasi di replicazione a rischio di errore per Oz. Inoltre, solo REV1 incorpora la citosina di fronte a Oz, e la frequenza di inserimento della citosina segue l’ordine Oz > guanidinoidantoina (Gh) > THF > 8-oxoG . Dato che REV1 può interagire con le DNA polimerasi, i risultati collettivi fino ad oggi suggeriscono che REV1 insieme alla DNA polimerasi ζ potrebbe prevenire le trasversioni G:C-C:G . Tali sistemi per prevenire la mutazione sono visti in altre DNA polimerasi.

Reazione di oligonucleotidi contenenti oz con enzimi di riparazione

Le cellule utilizzano una serie di meccanismi per prevenire gli effetti mutageni dei tipi sopra descritti di danni al DNA, e hanno vari enzimi che riparano i danni al DNA come 8-oxoG .

L’E. coli formamidopyrimidine DNA glycosylase e gli enzimi endonucleasi III escono Oz da oligomeri di DNA a doppio filamento. Inoltre, le NTH1 e NEIL1 umane, che sono omologhe delle endonucleasi III e VIII di E. coli, rimuovono Oz con la stessa efficienza con cui rimuovono il 5-idrossiuracile, e la loro reattività verso Oz è superiore a quella verso 8-oxoG. Poiché Oz è più sensibile di 8-oxoG al trattamento con piperidina, questa differenza di reattività dipende dalla forza del legame N-glicosidico.

Abbiamo analizzato le attività di incisione di altri enzimi di riparazione su Oz. La pirimidina dimero glicosilasi del virus Chlorella, che mostra un’attività di incisione verso il dimero della pirimidina ciclobutano, reagisce con il DNA a doppio filamento contenente Oz. La sua reattività verso Oz è superiore a quella verso 8-oxoG, indicando che la reattività dipende dalla forza del legame N-glicosidico, simile a NEIL1 e NTH1 umani. Tuttavia, questo enzima di riparazione mostra un’attività moderata verso Oz rispetto alla sua attività verso il dimero della pirimidina ciclobutano.

L’endonucleasi IV, un’endonucleasi apurinica/apyrimidinica, ha inciso Oz con un’attività osservata da un terzo a un quarto di quella verso THF, ma con maggiore efficienza rispetto alla sua attività verso Gh. Questi risultati suggeriscono che Oz può essere strutturalmente più simile a un sito abasico che non Gh.

L’endonucleasi V, che mostra attività verso i residui di ipoxantina, è anche attiva verso Oz. Questa attività è inferiore a quella verso l’ipoxantina ad alte concentrazioni di endonucleasi V, ma l’endonucleasi V riconosce Oz in modo molto più efficiente di Gh. L’endonucleasi V può riconoscere l’uracile ma non la timina, suggerendo che il gruppo 5′-metile è fondamentale per il riconoscimento da parte dell’endonucleasi V. Come descritto in precedenza, a differenza della struttura ad anello chiuso di Oz (Fig. 1), Gh ha una moiety che sporge dall’anello, simile alla timina. Così, l’endonucleasi V può riconoscere Oz ma non Gh.

L’umana OGG1 e l’endonucleasi AP 1 non possono escidere i residui di Oz, e la glicosilasi 1 monofunzionale uracile-DNA monofunzionale non mostra attività di incisione verso Oz (dati non mostrati). E. coli Mut Y non può agire sulle lesioni Oz:G e Oz:A (dati non mostrati). Oz è un substrato debole per la riparazione di escissione nucleotidica umana perché il sito danneggiato è meno ingombrante di quello dei fotoprodotti pirimidinici (6-4) pirimidone, rendendo difficile per XPC-RAD23B riconoscere Oz.

I dati disponibili fino ad oggi indicano che NEIL1 e NTH1 umani sono gli enzimi di riparazione più probabili per Oz. Tuttavia, NEIL1 umano, NTH1, E. coli endonucleasi III e formamidopirimidina glicosilasi del DNA possono tutti eliminare Oz dal DNA a doppio filamento, indipendentemente dal tipo di base opposta a Oz. Se la base opposta a Oz è adenina, guanina o timina prima della riparazione dell’escissione della base, l’informazione genetica è alterata nelle repliche successive. Così, ci possono essere enzimi sconosciuti che possono rimuovere accuratamente Oz da oligonucleotidi in cui Oz è accoppiato a una C, proprio come l’umano OGG1 può rimuovere 8-oxoG. In alternativa, come menzionato in precedenza, REV1-DNA polimerasi ζ può impedire le trasversioni G:C-C:G.

Oz ostacola la sintesi del DNA da parte delle DNA polimerasi?

Le guanine contigue (GG), che esistono in molte importanti regioni genomiche come l’oncogene K-ras, sono ossidate più facilmente di una singola guanina a causa del loro potenziale redox inferiore. L’ossidazione delle sequenze GG in condizioni di alta ossidazione risulta in una lesione contigua di guanina ossidata. Abbiamo precedentemente segnalato che IzIz è prodotto dall’ossidazione di GG in DNA a singolo e doppio filamento, suggerendo che l’idrolisi di queste molecole Iz produce due molecole Oz contigue (OzOz). Ci si aspetta che OzOz blocchi la sintesi del DNA più efficacemente di un singolo Oz e quindi rappresenti un danno al DNA più grave di un singolo Oz.

La nostra analisi ha mostrato che la DNA polimerasi κ non ha incorporato alcun nucleotide opposto a OzOz . Il frammento Klenow exo- ha incorporato preferenzialmente un’adenina opposta al 3′ Oz delle lesioni OzOz, REV1 ha incorporato la citosina e la DNA polimerasi β ha incorporato la guanina. DNA polimerasi α incorporato guanina, adenina e citosina di fronte al 3′ Oz di lesioni OzOz, e guanina è stato incorporato più facilmente di adenina e citosina. La DNA polimerasi ι ha leggermente incorporato guanina, adenina e timina. Sia che una base sia incorporata o meno, queste polimerasi non possono allungare il primer fino alla lunghezza completa attraverso OzOz.

Al contrario, la DNA polimerasi η ha allungato il primer fino alla lunghezza completa attraverso le lesioni OzOz con efficienza modesta rispetto alle lesioni del dimero ciclobutano pirimidina, con la sintesi della maggior parte dei filamenti di DNA in stallo al 3′ o 5′ Oz di OzOz. Al contrario, la DNA polimerasi ζ potrebbe allungare in modo efficiente il primer fino alla lunghezza completa attraverso OzOz, suggerendo che la DNA polimerasi ζ è un enzima importante per la sintesi di translesioni oltre le molecole Oz singole e contigue. Inoltre, la DNA polimerasi ζ incorpora tutti i nucleotidi opposti sia al 3′ che al 5′ Oz ed è una DNA polimerasi a rischio di errore per OzOz.

Fotoossidazione nel DNA quadruplex

Le sequenze ricche di guanina come i telomeri possono piegarsi in strutture quadruplex . Nel DNA a doppio filamento, l’ossidazione a un solo elettrone della guanina nelle sequenze contigue di guanina dipende dalla localizzazione dell’orbitale molecolare più occupato (HOMO). A differenza del DNA a doppio filamento, la 3′-guanina di d(TGGGGT) è principalmente ossidata nel DNA quadruplex, e l’HOMO stimato è localizzato sulla 3′-guanina (Fig. 4b). Data la nostra attuale comprensione del DNA a doppio filamento e del DNA quadruplex, l’ossidazione selettiva a un elettrone della guanina avviene all’HOMO localizzato indipendentemente dalla struttura del DNA.

D’altra parte, i prodotti di ossidazione della guanina dipendono dalla struttura del DNA. Per esempio, Iz è il prodotto principale nel DNA a singolo filamento, mentre 8-oxoG e deidroguanidinoidantoina (Ghox) si formano principalmente nel DNA quadruplex. Iz, 8-oxoG, Ghox e Gh si formano nel DNA a doppio filamento, e sono anche i principali prodotti di ossidazione che si trovano nel DNA a singolo filamento e quadruplex.

Il meccanismo di ossidazione della guanina nel DNA a singolo filamento, a doppio filamento e quadruplex può essere spiegato come segue. L’ossidazione a un solo elettrone della guanina genera un radicale catione guanina (G-+), seguito da due vie di degradazione (Fig. 5). In un percorso, G-+ è deprotonato in posizione N1, seguito dalla generazione di Iz. In un altro percorso, G-+ è idratato e deprotonato, seguito dalla generazione di 8-oxoG, Ghox e Gh. C’è un legame idrogeno tra il protone N1 di G-+ e l’O6 della guanina nel DNA quadruplex (Fig. 6a), e un legame idrogeno si forma tra il protone N1 di G-+ e l’N3 della citosina nel DNA a doppio filamento (Fig. 6b). Pertanto, la deprotonazione di G-+ è significativamente inibita nel DNA quadruplex e parzialmente inibita nel DNA a doppio filamento. Stimiamo che la facilità di deprotonazione segua l’ordine: DNA a singolo filamento > DNA a doppio filamento > DNA quadruplex, e questo ordine spiega le differenze nei prodotti di ossidazione in ogni tipo di struttura del DNA.