La microscopia confocale offre molti vantaggi rispetto alla tradizionale microscopia a largo campo per le applicazioni delle scienze della vita. Permette il controllo della profondità di campo e la capacità di raccogliere sezioni ottiche seriali da campioni spessi. La microscopia confocale può essere usata per creare immagini 3D delle strutture all’interno delle cellule. Esaminare queste strutture può aiutare i ricercatori a osservare il funzionamento interno dei processi cellulari.

Nei microscopi ottici convenzionali ad ampio campo, la fluorescenza secondaria emessa da un campione spesso si verifica attraverso il volume eccitato e oscura la risoluzione delle caratteristiche che si trovano nel piano focale dell’obiettivo. I campioni più spessi presentano un grado di fluorescenza così elevato che gran parte dei dettagli viene persa. Le tecniche di filtraggio spaziale eliminano la luce fuori fuoco nei campioni il cui spessore supera l’immediato piano di messa a fuoco.

Avanzi nella microscopia confocale

La scansione laser confocale e la microscopia confocale a disco rotante permettono ai ricercatori di generare immagini 3D di organelli all’interno di cellule viventi. Immagini di alta qualità possono essere ottenute da campioni preparati per la microscopia a fluorescenza convenzionale. C’è anche un numero crescente di applicazioni di biologia cellulare che richiedono l’imaging di cellule e tessuti sia fissi che viventi.

I recenti progressi nella microscopia confocale hanno reso possibili viste multidimensionali di cellule e tessuti viventi che includono informazioni di immagine in 3D nel tempo. Queste informazioni sono presentate in più colori. Avere dati temporali raccolti da esperimenti time-lapse o attraverso l’acquisizione di immagini in tempo reale è un potente strumento per la biologia cellulare. Le capacità della microscopia confocale aumentano con lo sviluppo di nuovi sistemi laser per limitare i danni alle cellule e con l’aumento della velocità di elaborazione dei computer e delle capacità di memorizzazione.

Microscopia confocale a scansione laser

Il vantaggio principale della microscopia confocale a scansione laser è di produrre sezioni ottiche sottili attraverso campioni fluorescenti che hanno uno spessore superiore ai 50 micrometri. Le immagini sono raccolte coordinando i cambiamenti incrementali nel meccanismo di messa a fuoco fine del microscopio (usando un motore passo-passo) con l’acquisizione sequenziale dell’immagine ad ogni passo.

Il contrasto e la definizione sono notevolmente migliorati rispetto ad altre tecniche grazie alla riduzione della fluorescenza di fondo e al miglioramento del segnale-rumore. Vengono anche rimossi gli artefatti che si verificherebbero durante il sezionamento fisico o la colorazione fluorescente con il sezionamento ottico. I campioni viventi possono essere esaminati in una varietà di condizioni con maggiore chiarezza.

Microscopia confocale a disco rotante

Il microscopio confocale a disco rotante permette ai ricercatori di utilizzare livelli di luce inferiori e di ottenere una fisiologia cellulare più accurata con concentrazioni di fluoroforo inferiori. I vantaggi di fornire un imaging più efficiente a potenze laser inferiori includono meno photobleaching, fototossicità ed è meno costoso dei microscopi confocali a scansione laser.

I numerosi vantaggi che la microscopia confocale offre rispetto alla microscopia convenzionale a largo campo per le applicazioni delle scienze della vita aiutano i ricercatori a osservare il funzionamento interno dei processi cellulari.

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