Cardellini ha ricevuto il suo primo ruolo di grande successo nel 1996 quando ha ottenuto un ruolo da protagonista come Sarah nella serie per bambini live-action del sabato mattina della ABC, Bone Chillers. In seguito, ha fatto apparizioni come ospite in programmi di prima serata come Step by Step, Clueless, 3rd Rock from the Sun, e Boy Meets World nel ruolo di Lauren, una ragazza che si frapponeva tra la coppia protagonista dello show. La Cardellini ha recitato nella prima stagione della serie AMC The Lot nel 1999, e ha passato l’estate in Europa come parte di una produzione itinerante di Lancelot, una tragedia olandese del XIV secolo.
Cardellini ha avuto il suo primo grande successo quando ha ottenuto uno dei ruoli principali nella serie della NBC Freaks and Geeks, che ha debuttato durante la stagione 1999-2000. Nei panni di Lindsay Weir, una studentessa modello nel bel mezzo di una crisi d’identità, la Cardellini ha ottenuto un riscontro positivo che l’ha successivamente catapultata alla fama. Cardellini ha recitato nell’adattamento live-action di Scooby-Doo nel 2002, in cui ha interpretato il personaggio dei cartoni animati Velma Dinkley. In seguito ha ripreso il ruolo di Velma in Scooby-Doo 2 del 2004: Monsters Unleashed. Si è unita al cast del dramma ospedaliero ER nel 2003 come Samantha Taggart, un’infermiera dallo spirito libero. La Cardellini ha recitato per sei stagioni in ER, fino al finale della serie, “And in the End…”, e con il cast ha vinto il TV Land ensemble Icon Award nel 2009.
I suoi altri lavori cinematografici includono ruoli in Dead Man on Campus, Strangeland, Good Burger, Legally Blonde, Brokeback Mountain (per cui è stata nominata per il Gotham ensemble e lo Screen Actors Guild Award), e un ruolo da protagonista nel film di Happy Madison Grandma’s Boy nel ruolo di Samantha. È stata la voce di Ursula nel videogioco di ruolo Gladius, e ha interpretato la voce di Bliss Goode nella serie animata della ABC The Goode Family. Nel 2007, la Cardellini è stata scelta per interpretare l’innamorata Clara nella miniserie della CBS Comanche Moon, un prequel di Lonesome Dove del 1989.
Nel 2010 e 2011, la Cardellini è tornata sul palco con il gruppo comico Dr. God a Los Angeles e San Francisco, è apparsa in Kill the Irishman e Super, e ha recitato nel film indipendente Return. È apparsa con i membri del cast e i produttori di Freaks and Geeks e Undeclared al Paley Center for Media PaleyFest il 12 marzo 2011. Dal 15 giugno 2012 al 15 febbraio 2016, è stata la voce di Wendy nello show di Disney Channel Gravity Falls.
Cardellini dà voce periodicamente al podcast e al live show The Thrilling Adventure Hour, nei segmenti Sparks Nevada: Marshal on Mars. Nel 2013, è stata scelta per interpretare Sylvia Rosen, un interesse amoroso di Don Draper in Mad Men. Per la sua performance in Mad Men, ha ricevuto una nomination al Primetime Emmy Award per Outstanding Guest Actress in a Drama Series. A partire dal 2015, si è unita a Kyle Chandler in una nuova serie drammatica Netflix Bloodline, dai creatori di Damages. Lo show è stato cancellato nel 2016, e si è concluso dopo la terza stagione. Nello stesso anno, ha avuto anche un ruolo da protagonista come Sara Whitaker nel film commedia Daddy’s Home. Nel 2017, ha ripreso il suo ruolo nel film sequel Daddy’s Home 2.
Nell’agosto 2018, Cardellini è stata scritturata per co-protagonista con Christina Applegate nella serie dark comedy di Netflix Dead to Me. Ha debuttato il 3 maggio 2019. Per la sua performance, ha ricevuto il plauso della critica e una nomination al Primetime Emmy Award per Outstanding Lead Actress in a Comedy Series.
Nel 2019, ha recitato nel film horror The Curse of La Llorona.