Meccanismo della metastasi peritoneale

Il primo passo della metastasi peritoneale è l’esfoliazione delle cellule del cancro ovarico dal tumore primario nella cavità peritoneale. Il prerequisito per questa fase è la perdita del contatto cellula-cellula tra le cellule tumorali. Come menzionato in precedenza, il cancro ovarico può potenzialmente sorgere dalle cellule epiteliali delle tube di Falloppio o dall’epitelio superficiale dell’ovaio. Entrambi esprimono il classico marcatore epiteliale cadherina epiteliale (E-caderina). L’E-caderina svolge un ruolo chiave nel comportamento delle cellule epiteliali, nella soppressione dei tumori e nell’architettura dei tessuti attraverso la sua funzione di molecola di adesione cellula-cellula. È associata al citoscheletro di actina attraverso le catenine α, β e γ. Mentre E-caderina è direttamente coinvolta nella formazione di giunzioni di aderenza tra cellule epiteliali adiacenti, può anche regolare la formazione di giunzioni strette e desmosomi.

Quando il cancro progredisce da una forma benigna a una maligna, le cellule subiscono una transizione da epiteliale a mesenchimale (EMT). Questo comporta cambiamenti molecolari e morfologici in cui perdono le loro caratteristiche epiteliali e guadagnano tratti mesenchimali. Questo include una perdita dell’attaccamento compatto da cellula a cellula, la polarità e la forma cuboidale. Le cellule diventano più fusiformi e mobili. L’EMT comporta anche un cambiamento nell’espressione dei marcatori epiteliali e mesenchimali. Un aspetto molto importante di questa transizione è la perdita di espressione della E-caderina e un aumento concomitante dell’espressione della cadherina neurale (N-caderina). Questo si traduce in una riduzione dell’interazione cellula-cellula tra le cellule tumorali attraverso le loro giunzioni di aderenza e un aumento della capacità delle cellule tumorali di interagire con le normali cellule stromali presenti nel microambiente. Nel cancro ovarico, l’espressione di E-caderina può essere regolata trascrizionalmente e post-trascrizionalmente. ZEB-1, ZEB-2, Snail e Slug sono noti per reprimere E-caderina e possono essere regolati da diversi spunti esterni. Le vie di segnalazione che regolano l’EMT e l’espressione di E-caderina includono il fattore di crescita trasformante β (TGF-β), il fattore di crescita epidermico (EGF), il fattore di crescita degli epatociti (HGF), l’endotelina-1 (ET-1) e la proteina morfogenetica ossea 4 (BMP-4). Inoltre, la famiglia miR-200 di micro-RNA può anche regolare indirettamente l’EMT prendendo di mira ZEB-1 e ZEB-2, che si traduce nella derepressione di E-caderina. La diminuzione dell’espressione della famiglia miR-200 ha portato ad un aumento dell’espressione di ZEB-1 e ZEB-2, che ha represso la trascrizione di E-caderina e indotto l’EMT nel cancro ovarico.

La perdita di espressione di E-caderina e la conseguente diminuzione del legame cellula-cellula promuove la diffusione delle cellule nella cavità peritoneale. È interessante notare che la perdita di espressione di E-caderina ha portato a un’induzione dell’espressione di α5-integrina. α5-integrina forma un eterodimero con β1-integrina che si lega alla fibronectina e quindi è chiamato recettore della fibronectina. L’induzione di α5-integrina non è avvenuta attraverso la via canonica della β-catenina. Invece, era attraverso il percorso del recettore del fattore di crescita epiteliale (EGFR)/focal adhesion kinase (FAK)/mitogen-activated protein kinase (MAPK). L’aumento dell’espressione del recettore della fibronectina è stato trovato per aiutare le cellule disseminate del cancro ovarico ad attaccarsi alla fibronectina secreta dalle cellule mesoteliali che rivestono l’omento e il peritoneo. Questa è una prova di come la perdita di E-caderina – che facilita lo spargimento – è accoppiata alla preparazione delle cellule per riattaccarsi al sito metastatico distante.

Una volta che le cellule tumorali sono state sparse nel fluido peritoneale, influenza significativamente la prognosi del paziente come evidenziato dal 29% di tasso di ricaduta del cancro ovarico di stadio 1A rispetto al 59% di ricaduta dello stadio 1C. Tuttavia, una volta staccate dalla massa tumorale, le cellule tumorali devono affrontare diverse sfide per sopravvivere nel fluido peritoneale. Il fluido peritoneale è il risultato della continua secrezione di fluidi da parte dei capillari peritoneali. Questo aiuta a lubrificare gli organi adiacenti nella cavità peritoneale e permette l’assorbimento di fattori solubili attraverso il peritoneo. La maggior parte del liquido peritoneale viene restituito alla circolazione attraverso il drenaggio linfatico. Tuttavia, nei pazienti con cancro ovarico, l’aumento della perdita di vascolarizzazione indotta da alti livelli di fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) accompagnato dal blocco dei vasi linfatici da parte delle cellule tumorali porta alla formazione di ascite. Questa ascite è chiamata ascite maligna a causa della presenza di cellule tumorali galleggianti. L’ascite maligna facilita la diffusione delle cellule tumorali in tutta la cavità peritoneale.

Le cellule tumorali ovariche disseminate che galleggiano nell’ascite sia come sferoidi che come cellule singole sviluppano resistenza all’anoiki e acquisiscono proprietà simili alle cellule staminali del cancro. È interessante notare che la popolazione di cellule singole è risultata avere una percentuale maggiore di cellule staminali tumorali. Le cellule staminali tumorali arricchite dall’ascite hanno una capacità molto elevata di formare tumori xenografici nel topo. Proprio come le cellule staminali tumorali, gli sferoidi galleggianti e le cellule singole sono resistenti alla chemioterapia. La natura compatta degli sferoidi serve come un’ulteriore barriera fisica per gli agenti chemioterapici, impedendo alle cellule interne l’esposizione al farmaco. Nell’insieme, questo indica che le cellule tumorali che galleggiano nell’ascite sono staminali e chemioresistenti e hanno il potenziale per seminare nuovi tumori metastatici all’interno della cavità peritoneale.

Gli sferoidi hanno livelli elevati di E-caderina ed EpCAM e concomitante diminuzione dell’espressione di vimentina, metalloproteinasi di matrice (MMPs), e CD44. Pertanto, le cellule tumorali in metastasi dimostrano plasticità in termini di capacità di passare avanti e indietro dai fenotipi epiteliali e mesenchimali secondo le esigenze delle diverse fasi della metastasi. Oltre alle cellule tumorali, l’ascite ha diversi tipi di cellule normali che insieme formano il microambiente dell’ascite maligna e sostengono le cellule tumorali fluttuanti. I principali tipi di cellule non cancerose includono fibroblasti associati al cancro (CAF), cellule mesoteliali, cellule immunitarie, cellule staminali mesenchimali e piastrine. Queste cellule possono essere associate agli sferoidi di cancro o alle singole cellule. Possono anche esistere da sole, galleggiando nel liquido peritoneale. Queste cellule di supporto producono un milieu di fattori che aiutano la sopravvivenza delle cellule tumorali e la successiva colonizzazione del sito metastatico. Cellule come le piastrine offrono anche protezione dalla sorveglianza immunitaria rivestendo le cellule tumorali.

Sopravvissuto con successo al galleggiamento nei fluidi peritoneali, il prossimo obiettivo delle cellule tumorali ovariche in metastasi è quello di attaccarsi ai vari organi presenti nella cavità peritoneale. Le micrografie elettroniche di sezioni di peritoneo e omento normali hanno rivelato l’architettura del mesotelio che li ricopre. Il mesotelio consiste in un monostrato di cellule mesoteliali che sono molto strettamente unite da un capo all’altro per formare una barriera protettiva. Queste cellule mesoteliali servono a fornire una superficie scivolosa – attraverso la secrezione di glicosaminoglicani e lubrificanti – facilitando il normale movimento celomico e impedendo l’infezione e l’attacco delle cellule tumorali. Le cellule mesoteliali possono svolgere diverse funzioni come la secrezione di ECM, fattori di crescita e citochine infiammatorie per la riparazione e la rigenerazione dei tessuti, proteasi per la fibrinolisi e la prevenzione delle aderenze. Sono anche attivamente coinvolte nel movimento di fluidi e soluti attraverso le cavità sierose.

I primi esperimenti in vitro hanno rivelato che le cellule del cancro ovarico forzano la retrazione delle cellule mesoteliali dopo l’attaccamento al mesotelio. Più recentemente, Iwanicki et al. hanno dimostrato il ruolo del recettore della fibronectina (α5β1-integrina) espresso sulla superficie delle cellule di cancro ovarico che le aiuta ad attaccarsi alla fibronectina secreta sulla superficie delle cellule mesoteliali e promuove lo spostamento delle cellule mesoteliali attraverso forze di trazione mediate dalla miosina. Studi successivi hanno rivelato che le cellule del cancro ovarico con un fenotipo mesenchimale avevano una maggiore propensione per la rimozione mesoteliale. La secrezione di fibronectina da parte delle cellule mesoteliali è risultata essere indotta dalla loro interazione con le cellule di cancro ovarico in metastasi. Il TGF-β secreto dalle cellule tumorali ha attivato una via di segnalazione mediata da RAC1/SMAD nelle cellule mesoteliali, che ha portato all’upregulation trascrizionale del gene della fibronectina e ha anche indotto un fenotipo simile all’EMT nelle cellule mesoteliali. Questo probabilmente aiuterebbe nella successiva clearance mesoteliale e potrebbe anche potenzialmente servire come fonte di fibroblasti associati al cancro nel microambiente del tumore metastatico.

L’aumento dell’espressione del recettore della fibronectina nelle cellule del cancro ovarico è anche utile nell’accoppiare l’attaccamento alla segnalazione del fattore di crescita per promuovere le metastasi. L’inibizione dell’interazione di α5β1-integrina sulle cellule tumorali con la fibronectina sulla superficie dell’omento e del peritoneo in modelli xenografici di metastasi del cancro ovarico ha portato a una diminuzione del carico metastatico sia in prevenzione che in intervento. Poiché l’inibizione di α5β1-integrina può anche inibire l’angiogenesi, è stato ulteriormente indagato se gli effetti sulla metastasi fossero effettivamente dovuti all’interruzione dell’interazione della cellula tumorale umana α5β1-integrina con la fibronectina o quella della cellula endoteliale del topo α5β1-integrina. L’effetto di un anticorpo anti-murina α5β1-integrina-bloccante è stato confrontato con quello dell’anticorpo anti umana α5β1-integrina-bloccante. È interessante notare che l’anticorpo bloccante murino non ha mostrato alcun effetto significativo e, quindi, ha confermato il ruolo chiave delle interazioni della cellula tumorale α5β1-integrina con la fibronectina del microambiente nel promuovere la metastasi del cancro ovarico. Ulteriori indagini hanno rivelato che l’attivazione di α5β1-integrina ha portato all’attivazione e alla fosforilazione del recettore tirosin-chinasi c-Met indipendente dal suo ligando, il fattore di crescita epatocitario (HGF). Questa attivazione indotta dall’attacco del recettore del fattore di crescita porta ad un aumento dell’invasività e della crescita attraverso la successiva attivazione delle vie di segnalazione FAK/Src nelle cellule tumorali. L’espressione di una FAK costitutivamente attiva potrebbe abrogare gli effetti inibitori dell’anticorpo bloccante l’α5β1-integrina sulle cellule tumorali ovariche.

Un altro effetto dell’adesione delle cellule tumorali ovariche alla superficie dell’omento è l’aumento della secrezione della proteasi extracellulare MMP-2. Essa scinde la fibronectina e la vitronectina presenti sulla superficie del mesotelio in frammenti più piccoli, il che aumenta il legame delle cellule tumorali a queste ECM attraverso i loro specifici recettori integrinici α5β1-integrina e αvβ3-integrina, rispettivamente. L’inibizione della MMP-2 nelle cellule tumorali ovariche come misura di prevenzione ha inibito la loro adesione all’omento nei topi nudi. Tuttavia, la MMP-2 ospite non ha giocato un ruolo in questo processo, come evidenziato negli esperimenti di xenotrapianto di topi knockout MMP-2.

Una volta che le cellule tumorali si attaccano alle cellule mesoteliali sulla superficie dell’omento, intraprendono un processo di adattamento al nuovo microambiente del sito di metastasi. Come evidenziato dalle interazioni ECM-cellule tumorali e dalle loro conseguenze di cui sopra, interazioni reciproche più produttive tra le cellule tumorali e il loro nuovo microambiente sono essenziali per il successo dell’insediamento dei tumori metastatici. Le cellule tumorali devono passare dall’anoikis di sopravvivenza mentre galleggiano nel fluido peritoneale a una crescita attaccata in presenza di nuovi ECM e fattori di crescita disponibili nel microambiente dell’omento e del peritoneo. Questo comporta cambiamenti significativi nei profili di espressione genica delle cellule tumorali colonizzatrici e, quindi, comporterebbe l’attivazione/repressione di regolatori trascrizionali/traslazionali dipendenti da spunti microambientali. Uno di questi importanti regolatori traslazionali regolati dal microambiente è stato riportato essere il micro-RNA miR-193b. miR-193b è un micro-RNA soppressore del tumore che è stato trovato per essere downregolato nel cancro ovarico metastatizzante al momento della loro interazione con le cellule mesoteliali che coprono la superficie dell’omento. Questa downregolazione ha promosso la crescita e l’invasività delle cellule tumorali in vitro, la colonizzazione dell’omento umano ex vivo e ha diminuito la metastasi negli xenotrapianti di topo. È interessante notare che la downregulation del miR-193b è stata indotta dall’ipermetilazione del suo promotore come risultato del cross talk tra le cellule tumorali e le cellule mesoteliali. L’ipermetilazione del promotore è stata catalizzata dall’aumento dell’espressione di DNMT1 nelle cellule tumorali stimolate dalla loro interazione con il mesotelio. Il miR-193b è stato trovato come bersaglio diretto dell’urochinasi. Una diminuzione dell’espressione di miR-193b ha portato a un aumento dell’espressione di urochinasi, che ha mediato gli effetti funzionali di miR-193b nel guidare la colonizzazione metastatica dell’omento.

Quando le cellule tumorali si adattano al nuovo microambiente del sito metastatico e iniziano a proliferare, reclutano anche cellule normali residenti e non residenti e le convertono nello stroma associato al tumore o ‘stroma attivato’. È noto che i tumori sono costituiti per il 10-50% da cellule non tumorali o dallo stroma tumorale. I componenti chiave di questo stroma tumorale sono i fibroblasti associati al cancro (CAF), i macrofagi associati al tumore (TAM), e altre cellule immunitarie, cellule endoteliali, periciti, adipociti, proteine della matrice extracellulare, ecc. Tutti questi componenti stromali sono essenziali per il successo della crescita e della progressione dei tumori, in quanto sono una fonte critica di fattori di crescita e tropici, aiutano ad eludere la sorveglianza immunitaria, l’angiogenesi, il rimodellamento della ECM, l’invasività, ecc. Pertanto, il successo finale delle cellule tumorali nel colonizzare l’omento dipenderà dalla loro capacità di sviluppare uno stroma tumorale attivo.

Le cellule tumorali ovariche in metastasi sono state trovate per reclutare i fibroblasti normali residenti nella membrana basale dell’omento e riprogrammarli in CAF. Questa riprogrammazione è stata guidata dalla diminuzione dell’espressione di miR-214, miR-31, e un aumento dell’espressione di miR-155 nei fibroblasti normali indotti dalle cellule tumorali. I CAF risultanti hanno promosso la migrazione delle cellule del cancro ovarico, l’invasione e la formazione di colonie in vitro e la crescita del tumore e le metastasi in vivo. È interessante notare che i CAF potrebbero essere riconvertiti in fibroblasti normali dalla sovraespressione combinata di miR-214 e miR-31 e dall’inibizione di miR-155. I micro-RNA hanno mediato i loro effetti attraverso una serie di obiettivi, la maggior parte dei quali sono stati identificati come chemochine e citochine. Il principale mediatore è risultato essere CCL5, che era un bersaglio diretto del miR-214. L’inibizione di CCL5 in topi nudi iniettati con una miscela di cellule di cancro ovarico e CAF ha diminuito significativamente la capacità delle CAF di promuovere la crescita del tumore e le metastasi. Fino a poco tempo fa, non si sapeva molto sul ruolo diretto degli adipociti dell’omento nel promuovere le metastasi del cancro ovarico nell’omento, anche se è ben stabilito che l’omento è uno dei principali siti di metastasi del cancro ovarico e che è un tessuto prevalentemente grasso. Il gruppo del Dr. Lengyel ha continuato a dimostrare che gli adipociti omentali secernono adipochine che promuovono l’homing delle cellule di cancro ovarico in metastasi nell’omento. Le cellule tumorali, in seguito, potrebbero indurre la riprogrammazione metabolica degli adipociti e indurre la lipolisi in essi. Gli adipociti a loro volta hanno indotto l’espressione di FABP4, un trasportatore di acidi grassi, nelle cellule tumorali. Come risultato di questo, le cellule tumorali assumono in modo efficiente gli acidi grassi liberi rilasciati dagli adipociti e li utilizzano come fonte di energia e di elementi costitutivi per guidare la crescita tumorale. Questo spiega perché il tumore dell’omento è di solito il più grande nella cavità peritoneale e a volte l’intero omento si trasforma in una torta omentale solida e dura. A quel punto, tutti gli adipociti sono stati esauriti e utilizzati per la crescita del tumore metastatico.