DISCUSSIONE
L’amplificazione dell’acido nucleico mediante RT-PCR o altre tecniche fornisce una diagnosi più accurata della meningite EV rispetto alle tecniche precedentemente disponibili, come la coltura virale. Con la disponibilità di queste tecniche diagnostiche sensibili, molti campioni di CSF sono ora sottoposti a test dell’acido nucleico EV. Abbiamo monitorato il profilo del CSF, compresa la conta dei leucociti e il livello delle proteine, per aiutare a valutare le prestazioni della RT-PCR EV usata nel nostro laboratorio. Ora abbiamo analizzato i dati basati sui campioni sottoposti a EV RT-PCR durante il periodo di 3 anni dal 2001 al 2003 per rivalutare la relazione tra i parametri CSF e la presenza di infezione EV del sistema nervoso centrale (CNS). Durante uno di quegli anni, un grande focolaio di WNV si è verificato nella nostra zona, permettendoci di valutare l’impatto della presenza di un altro patogeno neurotropico sul rapporto tra anomalie nel profilo CSF e la possibile presenza di EV RT-PCR. I nostri risultati possono essere utili per i clinici e gli operatori di laboratorio che cercano di ottimizzare l’uso dei test dell’acido nucleico EV.
L’obiettivo principale del nostro studio era la relazione tra la conta dei leucociti nel CSF e i risultati della RT-PCR EV. Eravamo interessati a determinare la proporzione di pazienti con infezione del SNC da EV e una conta leucocitaria del liquor elevata. Eravamo anche interessati a determinare la proporzione di pazienti con conteggi elevati di leucociti nel CSF che erano dovuti all’infezione da EV. I nostri dati mostrano che entrambe queste proporzioni sono fortemente influenzate dall’età. La scoperta di una mancanza di pleocitosi del CSF nei campioni di CSF che erano positivi per l’RNA EV era in gran parte limitata ai bambini sotto i 2 mesi di età ed era abbastanza comune (28%) in questo gruppo di età, probabilmente riflettendo l’immaturità immunologica di questi pazienti. Si è tentati di ipotizzare che una risposta chemochinica necessaria per il reclutamento di leucociti al sito di infezione non si era ancora sviluppata in questi pazienti. Tra i pazienti più anziani, meno del 2% di quelli con infezione EV del SNC mancava di pleocitosi. Al contrario, il riscontro di pleocitosi nel CSF con una RT-PCR negativa per EV era più comune tra i campioni dei pazienti più anziani. Non sorprende che questo risultato sia stato anche più comune durante la stagione in cui un notevole focolaio di malattia da WNV si è verificato nella zona servita dal nostro laboratorio.
Studi precedenti più piccoli si sono anche concentrati su un confronto tra i risultati della RT-PCR EV e i parametri del CSF. Henquell et al. (5) hanno riferito di 61 pazienti con sintomi di meningite e hanno confrontato i risultati della coltura e della PCR EV con i risultati del CSF. Cinquantasei dei 61 pazienti (92%) erano positivi alla PCR, ma 9 pazienti che avevano >1,5 anni di età avevano una conta cellulare del CSF di <10 cellule/mm3 ed erano positivi alla PCR o alla coltura. Così, nel loro studio, la correlazione tra pleocitosi e positività EV RT-PCR non era buona. Böttner et al. (2) hanno riferito su una coorte di 70 pazienti con sintomi di meningite durante l’estate del 2000. In quello studio, 29 (46%) dei 61 test EV RT-PCR sul CSF erano positivi. La conta delle cellule del CSF variava da 2 a 1.820 cellule/mm3, con una media di 151. Gli autori hanno riferito che non c’erano differenze nei risultati di laboratorio tra i pazienti nel loro studio che erano EV RT-PCR positivi e quelli che erano negativi, ma non hanno fornito la conta dettagliata delle cellule del CSF. La spiegazione delle differenze tra i risultati di quegli studi e il presente studio non è chiara, ma potrebbe riflettere le differenze biologiche nelle EV rilevate o le diverse caratteristiche di prestazione dei test EV RT-PCR.
Uno degli aspetti interessanti del presente studio è quello di focalizzare l’attenzione sulle cause della pleocitosi del CSF nei pazienti il cui test EV RT-PCR è negativo. Una possibile spiegazione è che il test potrebbe non rilevare tutte le infezioni EV. Non conosciamo l’effettiva sensibilità analitica (molecolare) del test Chemicon in termini di capacità di rilevare bassi livelli di RNA virale. Abbiamo studiato la sensibilità e abbiamo scoperto che è dell’ordine di 2,0 volte la dose infettiva del 50% della coltura dei tessuti, ma non sappiamo quanti genomi EV questo rappresenta, né si sa quante particelle non infettive sono prodotte in un’infezione acuta nel CSF umano. Tuttavia, è improbabile che questa sia l’unica spiegazione dal momento che, nel nostro studio, 21 dei 148 pazienti (14%) che erano ≤ 2 mesi e 169 dei 549 pazienti (31%) che erano > 2 mesi avevano pleocitosi ed erano EV RT-PCR negativo. I primer e la sonda utilizzati nel nostro studio hanno dimostrato di rilevare tutte le 64 EV conosciute che infettano l’uomo, tranne 6 (13). Un EV, il coxsackievirus A15, non era disponibile per il test, e altri due che non sono stati rilevati con questa combinazione di primer e sonda, gli echovirus 22 e 23, sono stati riclassificati come parechovirus (16). I sei EV che non sono stati rilevati sono epidemiologicamente rari. Altre infezioni, come HSV, EBV e WNV, sono state diagnosticate in alcuni dei pazienti con pleocitosi, ma rappresentavano solo 18 infezioni o il 23% di tutti i pazienti in questo studio con pleocitosi e un EV RT-PCR negativo nell’anno 2002 (n = 77). È possibile che alcuni dei pazienti rimanenti abbiano avuto infezioni con altri agenti infettivi, come i parechovirus (16). Inoltre, alcuni dei casi osservati di pleocitosi in questo studio possono essere stati dovuti a cause non infettive di pleocitosi, comprese le reazioni a farmaci come il cotrimoxazolo, agenti antinfiammatori non steroidei e immunoglobuline per via endovenosa. L’infezione batterica del tratto urinario è stata anche implicata come causa di pleocitosi CSF nei bambini (18).
L’uso dei livelli di proteine CSF come indicatore della positività EV RT-PCR è stato considerato. Tuttavia, i dati hanno mostrato che il livello di proteine CSF non era né sensibile né specifico quando usato da solo, né ha aumentato la sensibilità o la specificità quando usato insieme alla pleocitosi. Le curve delle caratteristiche operative del ricevitore hanno mostrato che il livello delle proteine CSF da solo non ha mai avuto una specificità superiore all’80% in nessuno dei livelli di cutoff studiati, e in nessun gruppo di età né in nessuno dei tre livelli studiati la sensibilità e la specificità erano superiori all’80%. La migliore correlazione tra i livelli di proteine CSF e la positività EV RT-PCR si è verificata nei pazienti che avevano > 2 mesi di età all’80% del cutoff normale, dove la sensibilità era del 68% e la specificità del 78%.
La circolazione del WNV nella comunità durante la stagione 2002 EV era potenzialmente un fattore di confusione nell’uso dei marcatori CSF come correlati della positività EV RT-PCR. Infatti, i dati del test z della tabella33 confermano che c’erano differenze significative tra i dati delle stagioni 2001 e 2002 sulle specificità della pleocitosi da sola o della pleocitosi e/o del livello elevato di proteine come correlati della positività EV RT-PCR, forse a causa della presenza di WNV a St. Louis durante la stagione 2002. Nel 2002, c’erano 67 campioni di CSF da pazienti che avevano > 2 mesi che avevano pleocitosi che erano negativi alla EV PCR. Di questi, 10 (15%) erano positivi per WNV e 18 (27%) erano positivi per WNV o un altro virus. Se tutti e 18 questi falsi positivi sono stati rimossi dai calcoli del 2002, la specificità e il PPV sono aumentati dal 56% e dal 23%, rispettivamente, al 63% e al 29%. La specificità e il PPV per tutti i campioni di pazienti che avevano > 2 mesi nel 2001 erano rispettivamente del 62% e del 66%. La rimozione dei falsi positivi attribuibili alla presenza di altri virus non spiega ancora il calo del PPV dal 2001 al 2002. Altri fattori sconosciuti devono essere all’opera. Così, la presenza di un’altra causa (infettiva o altro) di pleocitosi liquorale nella comunità diminuisce la capacità del laboratorio di predire la positività EV basata sui risultati CSF.
Oltre a focalizzare l’attenzione sulle cause della pleocitosi liquorale diverse dall’infezione da EV, i risultati di questo studio hanno due applicazioni pratiche. La prima è che i laboratori che eseguono la RT-PCR di EV possono usare il confronto dei risultati della RT-PCR con il conteggio delle cellule del CSF per sviluppare metriche che possono essere usate come parte di un programma di garanzia della qualità per quel test. Sulla base della nostra esperienza, una metrica è che la RT-PCR EV dovrebbe essere positiva in circa il 75% dei neonati di età inferiore a 2 mesi con pleocitosi del CSF, in circa il 65% dei neonati e dei bambini di età compresa tra 2 mesi e 18 anni con pleocitosi del CSF, e in circa il 25% dei pazienti di età superiore a 18 anni con pleocitosi del CSF. Queste cifre sono derivate utilizzando i dati delle due stagioni in cui il WNV era assente o non molto comune. La circolazione di arbovirus noti o nuovi o di altri virus che possono causare la meningite deve essere considerata per l’analisi dei dati relativi a questa metrica, perché causerà una diminuzione della proporzione di pazienti con pleocitosi che hanno un risultato positivo di EV RT-PCR. I laboratori che non soddisfano questo standard possono trarre beneficio dall’investigare la sensibilità analitica del loro test, ma dovrebbero anche essere attenti alla possibile presenza di altri agenti che potrebbero causare pleocitosi nel CSF.
Una seconda metrica che può essere utilizzata per il controllo di qualità è che il test EV RT-PCR dovrebbe essere negativo in circa il 98% dei pazienti sopra i 2 mesi di età che non hanno pleocitosi del CSF, e in circa il 70% dei pazienti sotto i 2 mesi di età senza pleocitosi. Il rilevamento di EV RNA in una percentuale maggiore di pazienti che mancano di pleocitosi dovrebbe indurre i laboratori a considerare se può essere presente una contaminazione da PCR. Va notato, tuttavia, che queste percentuali probabilmente varieranno da una regione all’altra, da una popolazione di pazienti all’altra, da un test diagnostico all’altro, e da una stagione all’altra, forse a seconda della EV che sta circolando.
La seconda applicazione pratica dei risultati del presente studio è che i laboratori possono utilizzare questi dati per stabilire criteri per massimizzare l’efficienza dei test RT-PCR EV. Per esempio, poiché l’assenza di pleocitosi ha un valore predittivo superiore al 98% per un risultato RT-PCR negativo nei pazienti di età superiore ai 2 mesi, i laboratori possono scegliere di stabilire un cutoff per il test RT-PCR EV basato sulla presenza o assenza di pleocitosi. Utilizzando i dati del presente studio, l’applicazione di questo cutoff avrebbe portato ad escludere 223 dei 549 campioni (sulla base dei 549 campioni da pazienti che erano >2 mesi di età per i quali erano disponibili i conteggi delle cellule del CSF), con un fallimento nel rilevare solo 3 campioni positivi (1,3%) che sarebbero stati nel gruppo escluso di 223 campioni. I tre pazienti con infezione da EV ma senza pleocitosi avevano 5 mesi, 10 anni e 15 anni. Uno di questi pazienti (quello di 10 anni) era sospettato di avere una meningite da EV in virtù di un collo rigido, ma gli altri due avevano sintomi meno chiaramente associati alla meningite. Il paziente di 10 anni sarebbe stato probabilmente testato per EV sulla base del sospetto clinico piuttosto che della pleocitosi del CSF, ma gli altri due potrebbero non essere stati testati. Per tutti e tre i casi, il risultato positivo della PCR EV non ha avuto un impatto significativo sulla gestione del caso. Se una misura come quella che abbiamo suggerito viene adottata, raccomandiamo di applicarla ai pazienti con più di 2 mesi di età e di assicurare che esista un meccanismo che consenta il test nei singoli casi con un forte sospetto clinico di infezione da EV, indipendentemente dall’età del paziente o dalla presenza di pleocitosi liquorale. Ovviamente, un programma di screening basato sulla pleocitosi del CSF è pratico solo per i laboratori il cui accesso ai dati sulla conta delle cellule del CSF è sufficientemente rapido che l’applicazione del criterio di screening non ritarderebbe l’esecuzione del test. Studi precedenti hanno chiaramente dimostrato che i test EV devono essere eseguiti in modo molto tempestivo per avere un impatto sulla decisione clinica (14).