Risultati e discussione

La struttura tridimensionale di Mal d 1.0101 consiste in un β-sheet curvo a sette filamenti antiparalleli (β1-β7) che abbraccia una lunga elica al C-terminale della proteina (α3) e due eliche brevi consecutivi (α1, α2) (Figura Figura11). I bordi del foglio β sono formati dai filamenti β1 e β2, che sono collegati dalle eliche α1 e α2 che formano un supporto a forma di V per la parte C-terminale dell’elica α3. In totale, Mal d 1 contiene circa il 35% di β-sheet e circa il 25% di struttura elicoidale, concordando bene con le stime di struttura secondaria da infrarossi e dicroismo circolare.33-35 Come in altre proteine della famiglia PR-10, i filamenti β2 e β3 sono collegati da un motivo di loop ricco di glicina (Gly46-Asn47-Gly48-Gly49-Pro50-Gly51).insieme, questi elementi strutturali creano la grande cavità interna che è tipica per il canonico PR-10 fold. Dalla figura 11B è evidente che nel nostro insieme strutturale NMR di Mal d 1, gli elementi della struttura secondaria sono molto ben definiti e conformazionalmente omogenei in tutti i 20 modelli strutturali. Solo livelli leggermente elevati di eterogeneità conformazionale sono osservati per alcuni dei loop esposti al solvente che collegano gli elementi della struttura secondaria e il C-terminale della proteina.

Una caratteristica peculiare della piega PR-10 è la grande cavità interna.In Mal d 1.0101, il volume di questa cavità36 è circa 2230 Å3, che è paragonabile per dimensioni a quelle di altre proteine PR-10.5 Come riscontrato nell’allergene del polline di betulla Bet v 1 e in altri allergeni alimentari omologhi, in Mal d 1 la maggior parte degli aminoacidi che formano la superficie della cavità sono idrofobici (Figura 22). Gran parte della superficie della cavità interna è formata da residui di aminoacidi nel foglio β le cui catene laterali idrofobiche si trovano all’interno della proteina (Ile56 (β3), Val67 (β4), Ile71 (β4), Tyr81 (β5), Tyr83 (β5), Leu85 (β5), Ile98 (β6), Tyr100 (β6), Ile113 (β7))insieme a residui rivolti verso l’interno nella lunga elica anfifilicaα3 (Val132, Val134, Ala139, Leu142, Phe143, Ile146), le due eliche corte α1 (Phe22, Val23) e α3 (Ala26, Ile30), e regioni di loop (Ile38, Phe58, Tyr64, Ala90). Inoltre, alcune catene laterali polari e cariche si trovano all’interno della molecola e fanno parte della superficie della cavità, come Asp27 (α2), His69(β4), Ser115 (β7), e Lys138 (α3), così che la cavità stessa è effettivamente anfifila, come notato prima per il principale allergene del polline di betulla, Bet v 1.37 Nelle strutture di cristallo di altre proteine PR-10 la cavità è occupata da acqua, molecole ligandi anfifilici, o componenti del crystallizationbuffer.5 Per Mal d 1, non è attualmente noto se i ligandi si legano specificamente alla cavità o quale potrebbe essere la funzione biologica del legame dei ligandi.

(A) Cavità interna diMal d 1.0101, colorata secondo il potenziale lipofilo come implementato in MOE,32 dove le regioni idrofile sono colorate in blu e quelle lipofile in giallo. (B) Rappresentazione di superficie della struttura più bassa energysolution di Mal d 1.0101. I due ingressi anfifilici alla cavità interna sono indicati come ε1 (tra l’estremità N-terminale dell’elica α3 e i loop che collegano i filamenti β3-β4 e β5-β6) e ε2 (tra il bordo del foglioβ e l’estremità C-terminale dell’elica α3).

La cavità interna in Mal d 1 può essere raggiunta da due aperture (Figura 22). Un ingresso all’interno della proteina, ε1, è formato da residui nella metà N-terminale dell’elica α3 (His131, Val134) insieme ai loop che collegano i fili β3-β4 (Gln63, Tyr64) e i fili β5-β6 (Asp89). Insieme, questi aminoacidi creano un accesso anfifilico all’interno della proteina. Un secondo ingresso anfifilico, ε2, è presente sul bordo del foglio β tra l’elica α3 (Lys136, His140, Lys144, e Glu147) e il filo β1 (Asn7, Phe9, e Ser 11). Nelle strutture di soluzione NMR di Mal d 1 questo percorso di accesso è parzialmente ostruito dalla catena laterale di His140. Da notare che entrate nella cavità interna in posizioni simili sono state descritte anche per altri membri della famiglia delle proteine PR-10.5

La Figura 33 mostra il confronto di Mal d 1 con Bet v 1 e gli allergeni alimentari legati al polline di betulla della famiglia PR-10 le cui strutture sono state determinate finora. Nonostante il fatto che le identità di sequenza tra queste proteine siano solo leggermente superiori al 50% in alcuni casi, le loro strutture tridimensionali sono generalmente molto simili, con valori rmsd della spina dorsale per le strutture secondarie tipicamente inferiori a 2 Å.38 Alla luce della cross-reattività immunologica osservata tra Mal d 1 e il principale allergene del polline di betulla, Bet v 1, il confronto strutturale di queste due proteine è di particolare interesse. Il backbonermsd tra Mal d 1.0101 e l’isoforma iperallergica Bet v 1.0101 (61% di identità di sequenza) dell’allergene del polline di betulla è 2.13 Å (1.70 Å per gli elementi di struttura secondaria). Da notare che Mal d 1 e Bet v 1 differiscono in lunghezza di un aminoacido, e sono state fatte ipotesi divergenti sulla posizione del gap in Mal d 1. Sulla base degli allineamenti di sequenza degli allergeni alimentari PR-10 è stato proposto che il loop subito prima39,40 o subito dopo4,34,41,42 il filamento β7 sia un residuo più corto in Mal d 1. La nostra struttura della soluzione mostra che il loop subito prima del filamento β7 è quello che è più corto in Mal d 1.0101. I fili β6 (Glu96-Val105in entrambi Mal d 1.0101 e Bet v 1.0101) e β7 (Ser111-Thr121in Mal d 1.0101 e Ser112-Thr122 in Bet v 1.0101) occupano posizioni identiche e hanno uguali schemi di legame a idrogeno nei fogli antiparalleliβ di queste proteine. Essi sono collegati tramite loop composti da quattro residui (Cys-Gly-Ser-Gly in Mal d 1) e cinque residui (Thr-Pro-Asp-Gly-Glyin Bet v 1), rispettivamente, il che produce una piccola differenza strutturale in questi segmenti di loop tra le due proteine.

Confronto di PR-10 allergeni alimentari e vegetali con strutture note.(A) Sovrapposizione della struttura a più bassa energia di Mal d 1.0101 (verde, codice di adesione PDB 5MMU) con le strutture del principale allergene del polline di betulla Bet v 1.0101 (blu, 4A88), l’allergene della carota Dau c 1.0103 (arancione, 2WQL), l’allergene del sedano Api g 1.0101 (grigio, 2BK0), l’allergene della soia Glym 4.0101 (giallo, 2K7H), l’allergene della fragola Fra a 1E (rosso, 2LPX), e l’allergene della ciliegia Pru av 1.0101 (viola, 1E09). (B) Allineamento multiplo di questi allergeni ottenuto con Clustal Omega.53 Gli amminoacidi sono contrassegnati da asterischi (identici), punti (conservati) e punti (semiconservati). Sono indicati gli elementi della struttura secondaria presenti in Mal d 1.0101.

Mal d 1 è noto per avere una tendenza alla chimerizzazione mediata dalla cisteina, come dimostrato per l’isoforma Mal d 1.0108 mediante elettroforesi su gel non riducente e cromatografia di esclusione delle dimensioni.35 Come Mal d 1.0108, l’isoforma Mal d 1.0101 contiene un singolo cisteina, Cys107. Nella struttura tridimensionale della soluzione di Mald 1.0101 Cys107 si trova sulla punta C-terminale del filamento β7, con la sua catena laterale orientata verso la superficie della proteina. Per sondare lo stato di oligomerizzazione di Mal d 1.0101 nelle condizioni che abbiamo impiegato per la determinazione della struttura NMR (pH 6.9, 10 mM sodiumphosphate, 14 mol equiv di acido l-ascorbico, 298 K) abbiamo eseguitopulsed-field-gradient esperimenti di diffusione NMR. Abbiamo ottenuto un valore di 21.6 ± 0.8 Å per il raggio idrodinamico di Mal d 1.0101, che è paragonabile al raggio idrodinamico di monomerico Bet v1.0101 (20.1 Å) in condizioni sperimentali simili.21 Questo è coerente con la nostra osservazione che, utilizzando lo stesso buffer, Mal d 1.0101 eluisce da una colonna di esclusione dimensionale con un tempo di ritenzione che è praticamente identico a quello di Bet v1.0101. Questi risultati sono stati ulteriormente verificati dalla spettrometria di massa FT-ICR, che mostra che Mal d 1.0101 non forma dimeri o aggregati di ordine superiore.

La struttura in soluzione NMR di Mal d 1 mostra che questa proteina consiste in un foglio β antiparallelo altamente curvo e tre α-eliche che formano una grande cavità interna, in modo molto simile alle altre proteinePR-10.5 Questo è in accordo con la cross-reattività immunologica osservata tra Mal d 1 e il principale allergene del polline di betulla, Bet v 1, così come altri allergeni alimentari della famiglia delle proteine PR-10.4,43 Nella maggior parte dei pazienti il Betv 1 è l’agente sensibilizzante, mentre gli anticorpi IgE specifici per il Bet v 1 reagiscono successivamente in modo incrociato con il Mal d 1 e provocano una risposta allergica, come dimostra l’osservazione clinica che l’allergia alla mela si sviluppa solo dopo l’insorgenza della pollinosi da betulla.44

Secondo queste linee, esperimenti di inibizione incrociata di Mal d 1usingsera da pazienti allergici alla mela hanno mostrato che Mal d 1 condivide epitopi IgE con il principale allergene del polline di betulla, Bet v 1.4,43 Dal punto di vista strutturale, sono disponibili informazioni limitate sulla natura esatta degli epitopi di legame di Mal d 1 e Bet v 1. Informazioni strutturali dettagliate su una discontinuità sequenziale (cioè, conformazionale) delle cellule B in Bet v 1 sono state ottenute co-cristallizzando la particolare forma Bet v 1.0112 con un frammento legante l’antigene (Fab) derivato dall’anticorpo monoclonale IgG murino BV16.45 Questo epitopo è formato dal segmento tra Glu42 e Thr52 (incluso il motivo dell’anello ricco di glicina tra i filamenti β2 e β3), insieme a Arg70, Asp72, His76, Ile86, e Lys97 di Bet v 1, che copre circa il 10% (≈900 Å2) dell’intera superficie delle proteine. Il legame del BV16 a questo epitopo riduce in modo misurabile le interazioni sieroIgE, indicando che le IgE e le IgG monoclonali BV16 competono per la sovrapposizione delle superfici di legame su Bet v 1.46 Inoltre, la mutazione di un residuo centrale (Glu45→Ser) ha ridotto significativamente la capacità di legame delle IgE di Bet v 1, confermando il significato di questo particolare epitopo per le interazioni con le IgE.46

La figura 44A mostra la superficie di interazione molecolare che corrisponde all’epitopo BV16 nell’allergene della mela. In Mal d 1 questi residui formano una superficie contigua insieme a un residuo un po’ distale (Glu76), di forma e dimensioni simili all’epitopo BV16 di Bet v 1. Inoltre, gli aminoacidi che contribuiscono sono ampiamente conservati tra Mal d 1 e Bet v 1. Tredici dei 16 aminoacidi nell’epitopo BV16 sono identici, mentre solo 3 residui sono diversi in Mal d 1.0101 e Bet v 1.0101 (Figura Figura 44B). Questi dati forniscono quindi una ragione strutturale per la cross-reattività allergica osservata tra il polline di betulla e gli allergeni della mela. È interessante notare che gli studi mutazionali indicano che la capacità di Mal d 1 di legare le IgE del siero di pazienti con allergie al polline di betulla può essere aumentata aumentando la similarità dell’epitopo BV16 in Mal d 1 a quello di Bet v 1, indicando che questi aminoacidi sono effettivamente coinvolti nel legame di Bet v 1 specifico a Mal d 1.39

(A) Conformalepitopi di Mal d 1. I residui aminoacidici che corrispondono alla superficie di interazione molecolare tra l’IgG monoclonale BV16 e Bet v 1.0112 (residui Glu42-Thr52, Arg70, Asp72,Glu76, Ile86, e Lys97 in Mal d 1.0101) sono colorati in blu.45 Le posizioni aminoacidiche che hanno dimostrato di essere cruciali per il riconoscimento delle IgE di Mal d 1 nelle analisi mutazionali (Thr10, Ile30,Thr57, Ser111, Thr112, e Ile113) sono mostrate in verde (Ile30 e Ile113 si trovano all’interno della proteina e non contribuiscono alla superficie).13,34 (B) Somiglianze aminoacidiche tra Bet v 1.0101 e Mal d 1.0101 utilizzando un gradiente di colore dal lilla (altamente simile) al verde acqua (altamente simile). I residui dell’epitopo che sono diversi tra Bet v 1.0101 e Mal d 1.0101 sono etichettati. Le somiglianze sono state calcolate sulla base dei punteggi della matrice di sostituzione (BLOSUM62) come implementato in MOE.32

È probabile che Mal d 1 contenga più di un singolo epitopo conformazionale.47 Un certo numero di posizioni aminoacidiche che sono rilevanti per il riconoscimento delle IgE sono state identificate tramite analisi mutazionale.13,34 Per un mutante a cinque punti di Mal d 1.0108 (Thr10→Pro, Ile30→Val, Thr57 →Asn, Thr112→Cys e Ile113→Val) è stata riscontrata in vitro una capacità marcatamente ridotta di legare le IgE specifiche di Mald 1.34 I test di puntura della pelle in pazienti allergici alle mele, confrontando Mal d 1 selvaggio tipo con il mutante a cinque punti, hanno dimostrato una capacità significativamente inferiore della proteina mutante di indurre reazioni cutanee in vivo.48 Ulteriori esperimenti hanno dimostrato che il livello di riconoscimento delle cellule T di Mal d 1 selvaggio tipo è conservato nel mutante a cinque punti.34 Poiché questi cinque aminoacidi sono probabilmente coinvolti nelle interazioni con le IgE non solo in Mal d 1 ma anche in Bet v 1, potrebbero essere parte di epitopi comuni a reazione incrociata in questi due allergeni.49 Ciò è corroborato da studi mutazionali, che hanno dimostrato che i tratti di peptide che comprendono questi residui sono effettivamente coinvolti nella cross-reattività immunologica tra Mald 1 e Bet v 1.50 Inoltre, in uno studio indipendente, Ser111 è stato identificato come essenziale per il legame delle IgE a Mal d 1, e una mutazione Ser111→Cys ha determinato un’affinità significativamente ridotta per le IgE negli esperimenti di immunoblotting.13

La Figura 44A mostra che questi sei residui sono abbastanza dispersi sulla superficie proteica di Mal d 1 e che nessuno di questi aminoacidi si sovrappone all’epitopo del BV16. Gli aminoacidi Thr10, Ser111 e Thr112 formano un blocco comune sulla superficie della proteina, mentre Thr57 si trova a circa 37-39 Å di distanza e vicino all’epitopo BV16. Considerando che un epitopo di dimensioni tipiche (∼600-900 Å2)39 e di forma circolare avrebbe una lunghezza d’arco di 28-34 Å sulla superficie di Mal d 1, i residuiThr10, Ser111 e Thr112 sono probabilmente troppo lontani da Thr57 per far parte di un epitopo comune. I due residui rimanenti, Ile30e Ile113, non raggiungono la superficie della proteina in Mal d 1. Mentre Ile113 è vicino nello spazio al patch Thr10-Ser111-Thr112, la sua catena idrofobica è rivolta verso l’interno della proteina, dove partecipa a un piccolo nucleo idrofobico situato all’estremità interna della cavità della proteina (tra le eliche α1 e α3 e il foglio β). Il residuo Ile30 si trova anche all’interno della proteina con la sua catena laterale alifatica che fa parte della cavità interna e non contribuisce alla superficie della proteina.

Da notare, perché l’anello tra i filamenti β6 e β7 è più corto di un residuo in Mal d 1 che in Bet v 1, Ser111 e Thr112 di β7 in Mal d 1 occupano le posizioni β7 di Ser112 e Ile113 in Bet v 1. Il patch di superficie formato da Thr10, Ser111, eThr112 in Mal d 1 sembra quindi essere meno idrofobico del patch di superficie corrispondente in Bet v 1 (Thr10, Ser112, e Ile113). Infatti, anche la superficie proteica che circonda questi tre residui mostra un livello di somiglianza notevolmente inferiore tra Mal d 1.0101 e Bet v 1.0101 rispetto ad altre parti della superficie proteica, come si può vedere nella figura 44B. Questo potrebbe essere in parte responsabile delle diverse proprietà di legame alle IgE di questi allergeni. È stato notato, d’altra parte, che l’epitopecoincidenza tra Bet v 1 e Mal d 1 può essere limitata,47 come esemplificato da un recente studio che descrive l’isolamento di IgE umane legate a Bet v 1 ma non a Mal d 1.51 Inoltre, diverse isoforme di Mal d 1 contengono sostituzioni aminoacidiche all’interno delle potenziali superfici di interazione con le IgE,39 suggerendo che esse possono influenzare la reazione immunologica.

È chiaro che i dati strutturali ad alta risoluzione forniscono la base per determinare e confrontare i dettagli strutturali degli epitopi di legame (cross-reattivi) nelle proteine allergeniche. Inoltre, l’innesto di epitopi conformazionali mediante il trasferimento di tratti di residui tra allergeni omologhi è diventato un prezioso strumento sperimentale. L’innesto dell’epitopo è stato utilizzato per caratterizzare il ruolo dell’epitopo BV16 in Mal d 1 ricreando questo epitopo sulla superficie di Mal d 1, confermando la sua importanza per il legame delle IgE e la cross-reattività con Bet v 1.39 In un approccio ortogonale, diversi tratti di Mal d 1 che comprendono residui cruciali per il legame delle IgE sono stati trasferiti a Betv 1 per studiare il ruolo di questi segmenti strutturali per la cross-reattività,50 e sono state create chimere di Bet v 1 e Mal d 1 per mappare l’epitopo di una IgE monoclonale umana, che è stata isolata da una libreria di fagi, al C-terminale di Bet v 1.51 Inoltre, l’innesto dell’epitopo fornisce l’accesso ad allergeni chimerici con proprietà antigeniche finemente regolate, come la ridotta capacità di legare le IgE, per la diagnosi di allergia basata su molecole e l’immunoterapia specifica.52 La conoscenza dei dettagli strutturali di questi elementi allergenici è necessaria per generare chimere correttamente ripiegate, perché il trasferimento di tratti di struttura secondaria (in parte) non corrispondenti tra allergeni diversi può essere la causa della perdita del ripiegamento della proteina e, di conseguenza, della riduzione delle capacità di legame alle IgE.41 La struttura tridimensionale di Mal d 1.0101 presentata qui fornisce la base biofisica per chiarire i dettagli molecolari della cross-reattività immunologica in grande dettaglio.