DISCUSSIONE
In questo studio, presentiamo strutture di soluzione SAXS per Hb e Hb coniugata con due o sei-sette copie di 5-kD PEG. Questo è il primo esempio di determinazione strutturale 3D di un’emoglobina coniugata con PEG, anche se a bassa risoluzione. I risultati più importanti di questo studio sono: i), la coniugazione PEG non induce alcuna distorsione grossolana della struttura terziaria di Hb (a questa risoluzione), ma la sua struttura quaternaria appare compattata; ii), parte delle catene PEG entra in cavità tra le subunità Hb, parte rimane vicino alla superficie della proteina, e il resto sporge lontano dalla superficie; iii) la PEGilazione cambia la molecola sferica di Hb in una struttura allungata con due o sei PEG coniugati; iv) la coniugazione PEG porta alla repulsione tra le molecole di Hb PEGilate causata dallo strato di PEG che circonda la proteina Hb, che si manifesta con un marcato effetto concentrazione nei dati SAXS.
La dispersione sperimentale da Hb è ben adattata dalla curva calcolata dalla struttura cristallina di oxyHb, mentre la struttura cristallina di deoxyHb produce un adattamento peggiore. Sia P5K2 che P5K6 sono coniugati a Cys-β93 adiacente al prossimale His-β92, che è l’unico residuo nelle subunità β di Hb direttamente coordinate al ferro eme. Sembra probabile che l’attacco di un PEG 5-kD causi distorsioni strutturali locali e minori della tasca eme della subunità β che non sono rilevabili a questa risoluzione (∼12 Å). Questo è supportato da studi sulle cinetiche di perdita di eme che sono 5 volte più alte per la subunità β di P5K6 rispetto all’Hb non coniugata, mentre le subunità α mostrano cinetiche simili all’Hb (8). Coerentemente con questa interpretazione, gli studi 1H NMR di una Hb coniugata con PEG, che è simile nella struttura chimica alla P5K6 studiata qui, hanno mostrato uno spostamento dell’istidina prossimale delle subunità β ma non α (28). Inoltre, i residui nelle vicinanze di Cys-β93 si trovano in una regione conformazionalmente plastica che è direttamente collegata alle proprietà allosteriche di Hb (29,30).
Modifica dei residui Cys-β93 con N-ethyl maleimide da sola causa una perdita di cooperatività, e questo effetto, insieme alla compattazione della struttura quaternaria, può spiegare l’apparente perdita di cooperatività in Hemospan (5). Il movimento quaternario potrebbe essere limitato, dando luogo a una transizione solo parziale tra gli stati R e T o a una struttura quaternaria intermedia. Un tale effetto è stato considerato in precedenza per interpretare la cinetica del legame di O2 a Hemospan (7).
Dato che le porzioni grandangolari di scattering da Hb e PEG-Hb coincidono, significativi cambiamenti di struttura terziaria/secondaria dovuti alla PEGilazione possono essere esclusi, e i nostri risultati indicano quindi una struttura quaternaria più compatta della proteina PEGilata. Questo può essere spiegato da una parziale disidratazione delle interfacce intersubunità causata dalle catene PEG, che sono, piuttosto inaspettatamente, parzialmente situate all’interno del PEG-Hbs. La struttura quaternaria dell’oxyHb crea una cavità centrale tra le quattro subunità dell’emoglobina. La cavità può ospitare almeno 80 molecole d’acqua, come mostrato nella struttura cristallina ad alta risoluzione dell’oxyHb (27). Di conseguenza, il volume è sufficiente per il PEG per entrare nell’interfaccia intersubunità e spostare le molecole d’acqua situate all’interno del tetramero. Inoltre, il PEG è noto per causare la disidratazione ed è spesso usato come cosolvente per la cristallizzazione delle proteine. Insieme allo spostamento delle molecole d’acqua situate nella cavità centrale, una disidratazione generale può contribuire alla struttura quaternaria compatta del PEG-Hbs. Questa conclusione è coerente con le simulazioni di dinamica molecolare che hanno mostrato una correlazione tra l’estensione della PEGilazione e il volume molecolare del PEG-Hb, con un corrispondente spostamento delle molecole d’acqua dalla struttura dell’Hb (31).
Come la maggior parte delle catene di PEG si trova all’esterno dell’Hb, i nostri risultati concordano con studi precedenti che mostrano che il PEG è escluso preferenzialmente dalle proteine per esclusione sterica (32). Inoltre, ma in competizione con le forze di esclusione, il PEG ha dimostrato di interagire con i residui non polari della superficie delle proteine (32), e l’interazione del PEG 5-kD è stata riportata per i cluster idrofobici sulla superficie del citocromo c (33). Il punteggio di idrofobicità per Hb è stato calcolato secondo Kyte e Doolittle (34) (Fig. 6), mostrando i numeri dei residui allineati con i segmenti elicoidali. Una regione di particolare interesse nelle possibili interazioni PEG-Hb è sopra le eliche G-H relativamente idrofobiche ai contatti di imballaggio α1β1 tra i dimeri. I nostri modelli mostrano le interazioni di superficie del PEG con Hb, anche se la risoluzione è insufficiente per definire i residui Hb coinvolti o la loro polarità. L’analisi degli spettri SAXS registrati ad una concentrazione relativamente alta della proteina mostra un chiaro effetto di concentrazione sia per P5K2 che per P5K6, mentre questo effetto è quasi assente in Hb non coniugato. Come ci si potrebbe aspettare, l’effetto di concentrazione è più pronunciato per la P5K6 che per la P5K2, suggerendo che l’introduzione di catene PEG aggiuntive si traduce in una migliore schermatura della molecola di Hb, anche in accordo con i calcoli di dinamica molecolare di Hb teorica coniugata con PEG (31).
Parco di idrofobicità per Hb (34). Il punteggio di idrofobicità è mostrato per i numeri dei residui allineati con i segmenti elicoidali della subunità.
Intuitivamente, ci si aspetterebbe che il PEG-Hbs abbia la stessa forma dell’Hb non PEGilato, ma qui dimostriamo che la forma di una proteina PEGilata non è definita da quella della proteina centrale. La forma non sferica della soluzione del PEG-Hbs non è stata prevista e fornisce nuove informazioni per calcolare le costanti di diffusione del PEG-Hb usando l’equazione di Stokes-Einstein. Abbiamo riportato delle simulazioni del trasporto dell’ossigeno da parte di Hbs senza cellule, incluso PEG-Hb, dove la diffusione molecolare di Hb ha dimostrato di essere un fattore critico nel trasporto globale dell’ossigeno (35). Anche se la conclusione è valida, quello studio ha usato l’ipotesi semplificatrice che le molecole di Hb fossero sferiche. Poiché la struttura della soluzione SAXS contraddice questo presupposto, le dimensioni molecolari corrette possono ora essere impiegate per fornire simulazioni più accurate.
Inoltre, sebbene sia la P5K2 che la P5K6 abbiano forme e dimensioni complessive simili, la differenza nell’effetto repulsivo delle particelle in soluzione fornisce una proprietà altamente critica che può spiegare alcuni degli effetti positivi della Hbs PEGilata in vivo. La generalità di queste osservazioni può essere attribuita alle catene PEG attaccate e suggerisce che l’effetto di concentrazione è una conseguenza generale della coniugazione PEG. Di conseguenza, in vivo, si può ipotizzare che questo effetto non solo impedisca le interazioni intermolecolari tra proteine adiacenti coniugate con PEG, ma anche tra proteine coniugate e non coniugate o addirittura strutture cellulari.
Diversi benefici generali, come l’aumento del tempo di ritenzione intravascolare, la diminuzione dell’immunogenicità e il miglioramento della solubilità, sono spesso associati all’attacco di un polimero PEG a una proteina. Per esempio, l’attacco di un polimero PEG ramificato da 40 kDa all’interferone-β-1b ha notevolmente migliorato la sua emivita circolante da 1,1 h per la proteina non coniugata a 9,4 h per il farmaco coniugato con PEG; inoltre, l’attacco del PEG ha diminuito drasticamente l’immunogenicità della proteina e la tendenza all’aggregazione (4). La capacità della PEG-Hb di escludere altre proteine o cellule all’interno del suo volume escluso è particolarmente critica nella progettazione di terapie a base di ossigeno. I prodotti a base di emoglobina vengono ottimizzati per estendere il tempo di circolazione, minimizzando o eliminando la tossicità. Questo risultato è coerente con l’emivita circolatoria estesa di Hemospan, che è ∼20 h in assenza di emoglobinuria (14), rispetto alla clearance renale molto rapida dell’Hb non modificata, priva di cellule (36). Il prolungamento del tempo di circolazione di Hemospan può verificarsi se non si lega al recettore CD163 dei macrofagi, uno spazzino dell’Hb che mostra un legame progressivamente decrescente dell’Hbs polimerizzato con l’aumentare delle dimensioni (37). Gli studi con Hemospan in questo sistema sono in corso. Inoltre, la repulsione del PEG-Hb da altre cellule immunitarie può essere fondamentale per evitare risposte infiammatorie. Le teorie prevalenti sulla vasocostrizione indotta dall’emoglobina senza cellule sono che le molecole di Hb entrano in stretto contatto con l’endotelio (38) o stravaccano attraverso l’endotelio (39), il che renderebbe più efficiente lo scavenging di NO, portando così a un aumento del tono vascolare e agli effetti collaterali negativi di ipertensione e diminuzione della perfusione (40). Rimane speculativo a questo punto, ma la natura repulsiva della modifica PEG può ridurre la sua interazione con il glicocalice di superficie delle cellule endoteliali; così l’effetto repulsivo fornisce una spiegazione per la vasoattività diminuita con Hemospan (10).
Queste nuove intuizioni da questa analisi SAXS può ora essere utilizzato per progettare PEG-Hbs per effetti di repulsione massima o ottimale e dimensioni delle particelle e conformazioni PEG. Le forze repulsive intermolecolari aumentano sostanzialmente con la massa totale dei PEG coniugati con la stessa lunghezza del polimero (10 vs. ∼30 kD per P5K2 rispetto a P5K6), un effetto che non era previsto dai cambiamenti nella forma molecolare e/o nelle dimensioni. Quindi, le conformazioni in soluzione dei PEG coniugati, che includono la sua interazione con Hb, altri polimeri PEG e strati d’acqua circostanti, devono giocare un ruolo importante nell’effetto di repulsione.
Le lunghezze effettive dei PEG sono definite dalla dimensione di Flory, RF, che è determinata dalla lunghezza effettiva di un’unità di ossietilene, a = 3.5 Å (41), e dal numero di unità per polimero, N (42-44):
Le dimensioni relative di RF e la distanza tra i siti di innesto del PEG, DG, su una superficie determinano la struttura secondaria del polimero PEG innestato: per DG > RF, il polimero PEG è in grado di ripiegarsi su se stesso sulla superficie innestata, dando una conformazione a “fungo”; per DG < RF, i PEG si estendono a causa delle interazioni steriche tra le catene PEG per formare una conformazione a “spazzola”; e a DG ≈ RF, i PEG sono in una fase di transizione “fungo a spazzola” (45). Per il PEG 5-kD, N = 113 e RF ∼ 60 Å. Poiché la semimassima circonferenza DG sulla superficie Hb da un Cys-β93 all’altro sul lato simmetricamente opposto di Hb è ∼110 Å, DG > RF, permettendo così una conformazione a fungo dei polimeri PEG innestati in P5K2. Questo si riflette nelle caratteristiche del PEG dalla struttura SAXS di P5K2, che mostra una forma ellissoidale complessiva con Dmax = 115 Å. Il calcolo del diametro massimo per P5K2 usando la dimensione di Flory per PEG 5-kD dà una molecola con Dmax ∼ 190 Å (cioè, Hb diametro = 70 Å + PEGs, 2 × 60 Å), fornendo così una stima per la conformazione a fungo delle catene PEG su P5K2 che si piegano al ∼60% delle loro dimensioni Flory complete.
La molecola P5K6 più altamente PEG-coordinata contiene i due siti di attacco specifici (Cys-β93) e altri quattro o cinque siti PEG innestati. La struttura della soluzione SAXS implica che le catene PEG di P5K6 hanno una maggiore interazione sterica per formare una forma ancora più allungata rispetto a P5K2 (Fig. 4). Usando un’approssimazione secondo cui le catene PEG sono uniformemente distribuite sulla superficie di Hb, DG è diminuita a ∼55 Å, e DG ≈ RF, suggerendo così una conformazione PEG più estesa ma ancora in una transizione da fungo a pennello. Usando la dimensione massima di Flory rispetto al Dmax misurato = 130 Å, le catene PEG 5-kD su P5K6 sembrano piegarsi al ∼70% della loro dimensione Flory completa, coerente con un aumento dell’estensione PEG in P5K6 rispetto a P5K2 da vincoli sterici.
Con la determinazione diretta della dimensione delle particelle tramite SAXS combinata con l’analisi Flory, abbiamo previsto che P5K6 si trova in una transizione fungo-spazzola e quindi non è stato progettato per raggiungere la sua dimensione massima delle particelle quando i PEG coniugati sono completamente estesi. Nuove molecole PEG-Hb possono essere progettate per particelle più grandi, in modo che la DG < RF sia da: 1), creando una Hb più altamente coniugata con più siti di attacco PEG, diminuendo così DG, o 2), aumentando la lunghezza PEG, aumentando così RF. Raddoppiando la dimensione del PEG a 10 kD (cioè, P10Kx, dove x è il numero di siti di coniugazione), si aumenta RF a ∼90 Å, che prevediamo fornisca una conformazione a fungo in P10K2 ma si avvicini a una conformazione a spazzola più piena in P10K6. È, tuttavia, sconosciuto come l’estensione delle lunghezze del polimero PEG altera le interazioni steriche durante la reazione di coniugazione chimica PEG-Hb, e così nuovi disegni garantiscono la pratica sperimentale con rapporti di reazione in combinazione con studi SAXS per verificare il fungo-to-brush transition point.