細胞内のDNAは、内因性および外因性のさまざまな要因によって常に酸化されており、その結果生じるDNA損傷は、がんやその他の疾患の発症リスクを高める可能性があります。

DNA複製の際、グアニンの酸化生成物と反対側にアデニンが取り込まれるとG:C-T:A変換が起こり、グアニンの酸化生成物と反対側にグアニンが取り込まれるとG:C-C:G変換が起こります。 これらの変異（参考文献）は、多くの重要な遺伝子に見られ、特にp53癌抑制遺伝子のCpG部位やK-ras癌遺伝子のコドン12および13に見られる。

8-オキソ-7,8-ジヒドログアニン（8-oxoG）（図1）は、最も一般的な酸化的DNA損傷の一つであり、様々な酸化的条件で形成される。 8-オキソGは、様々な研究が行われており、生物学的な影響も大きく、酸化的に損傷を受けたDNAの普遍的なマーカーとなっている。 構造解析の結果、8-oxoGはantiまたはsynコンフォメーションをとることが明らかになった。antiコンフォメーションの8-oxoGはシトシンとワトソン・クリック塩基対を形成し、synコンフォメーションの病変部はHoogsteenエッジを利用してアデニンと塩基対を形成する（図2）。 さらに、DNAポリメラーゼは、8-oxoGの反対側にあるシトシンに加えてアデニンも取り込み、8-oxoGは大腸菌や哺乳類の細胞でG:C-T:A変換を誘導する。 1

8-oxoGはG:C-T:Aトランスバージョンを起こしますが、G:C-C:Gトランスバージョンの発生のメカニズムは8-oxoGでは説明できません。 また、8-oxoGはグアニンよりも酸化電位が低いため、より容易に酸化され、8-oxoGの酸化によってさまざまな酸化的病変が生じると考えられる。

G:C-C:G変換を引き起こすグアニン酸化生成物は、グアニンと水素結合して塩基対を形成する

前述のように、G:C-C:G変換は、グアニン酸化生成物の反対側にグアニンが取り込まれることで起こる。 このセクションでは、まず「Aルール」について説明します。 アデニンは、DNAポリメラーゼによって塩基性部位の反対側に組み込まれる最も一般的な塩基である。このことは、4つの天然塩基のうち、アデニンが最も疎水性の相互作用を形成し、塩基性部位との空間的適合性を示すことを示唆している。 このことは、アデニンが最も多くの疎水性相互作用を形成し、塩基配列との空間的適合性が高いことを示唆している。 一方、グアニンを優先的に挿入するためには、疎水性相互作用や空間的適合性に加えて、鋳型となる塩基との水素結合形成が必要となる。

Potential guanine oxidation products causing G:C-C:G transversions

Izは中性水溶液中でゆっくりと加水分解され、2,2,4-トリアミノ-5(2H)-オキサゾロン(Oz)となる（Fig. 1）にゆっくりと加水分解され、その半減期は生理的条件下で147分とされている。 また、肝臓のDNAには107個のグアニン塩基あたり2〜6分子のオズが検出され、最近では5-メチルシトシンの存在下でオズの量が著しく増加することが明らかになった。

Klenowのフラグメントexoは、in vitroではOzと反対側のアデニンを取り込み、大腸菌ではOzがG:C-T:Aトランスバージョンを起こします。 一方、我々のin vitroの反応系では、Klenow fragment exoはOzの反対側にアデニンまたはグアニンを取り込んでいます。 さらに、DNAポリメラーゼα、β、δ、εは、それぞれOzの反対側のグアニンのみを取り込み、DNAポリメラーゼγ、κ、Sulfolobus solfataricusのDNAポリメラーゼIVは、Klenow fragment exoに加えて、それぞれグアニンとアデニンを取り込み、DNAポリメラーゼηは、グアニン、アデニン、シトシンを取り込み、DNAポリメラーゼζとιは、それぞれグアニン、アデニン、シトシン、チミンを取り込み、REV1はシトシンを取り込むことを明らかにした。 これらの結果から、REV1以外のDNAポリメラーゼは、Ozとは逆にグアニンを取り込むことがわかった。 私たちは、オズがグアニンと安定した塩基対を形成し、このオズとGの塩基対は2つの水素結合を持ち、平面的であると予測しました（図3c）。

さらに、DNAポリメラーゼα、β、γ、δ、ε、η、κ、ζはそれぞれ、Ozを挟んでプライマーを完全に伸長させます。 このように、OzはG:C-C:G変換の誘導に関連した酸化された病変であると考えられる。 特に、DNAポリメラーゼζはOzを越えてもGを越えた場合とほぼ同じ効率で伸長するが、テトラヒドロフラン（THF：化学的に安定な塩基性部位のアナログ）、8-oxoG、O 6-メチルグアニンは越えない。 これらのデータは、DNAポリメラーゼ ζがOzのための効果的なエラー・プローン複製ポリメラーゼであることを示している。 さらに、REV1だけがOzの反対側にシトシンを組み込み、シトシンの挿入頻度はOz > グアニジノヒダントイン（Gh） > THF > 8-oxoGの順であった。 REV1がDNAポリメラーゼと相互作用することを考えると、これまでの結果から、REV1がDNAポリメラーゼζと一緒になってG:C-C:Gトランスバージョンを防いでいる可能性が考えられます。

修復酵素とozを含むオリゴヌクレオチドの反応

細胞は、上記のようなDNA損傷による変異原性を防ぐために、様々なメカニズムを利用しており、8-oxoGのようなDNA損傷を修復する様々な酵素を持っています。

大腸菌のホルムアミドピリミジンDNAグリコシラーゼやエンドヌクレアーゼIIIの酵素は、二本鎖DNAオリゴマーからOzを切除します。 また、大腸菌のエンドヌクレアーゼIIIおよびVIIIのホモログであるヒトのNTH1およびNEIL1は、5-ヒドロキシウラシルを除去するのと同様に、Ozを効率的に除去し、Ozに対する反応性は8-oxoGに対するものよりも高い。 オズはピペリジン処理に対して8-オキソGよりも感受性が高いことから、この反応性の違いはN-グリコシド結合の強さに依存していると考えられます。

私たちは、オズに対する他の修復酵素の切開活性を分析しました。 クロレラウイルスのピリミジン二量体グリコシラーゼは、シクロブタンのピリミジン二量体に切開活性を示しますが、Ozを含む二本鎖DNAと反応します。 Ozに対する反応性は8-oxoGよりも高く、ヒトのNEIL1やNTH1と同様にN-グリコシド結合の強さに依存していることが示された。

アプリン酸／アピリミジン系エンドヌクレアーゼであるエンドヌクレアーゼIVは、THFに対する活性の3分の1から4分の1の活性でOzを切開するが、Ghに対する活性よりも高い効率を示した。

ヒポキサンチン残基に対して活性を示すエンドヌクレアーゼVは、Ozに対しても活性を示す。

エンドヌクレアーゼVはヒポキサンチンに対して活性を示すが、Ozに対しても活性を示す。 エンドヌクレアーゼVはウラシルを認識できるが，チミンは認識できないことから，エンドヌクレアーゼVによる認識には5′-メチル基が重要であることが示唆される。 前述したように、Ozの閉環構造（図1）とは異なり、Ghはチミンと同様に環から突出した部分を持つ。

ヒトOGG1とAPエンドヌクレアーゼ1はOz残基を切り出すことができず、一本鎖選択的な単機能ウラシル-DNAグリコシラーゼ1はOzに対して切り出し活性を示さない（データは示されていない）。 大腸菌のMut Yは、Oz:GおよびOz:Aの病変に作用しない（データは示されていない）。 Ozがヒトのヌクレオチド除去修復の弱い基質であるのは、損傷部位がピリミジン(6-4)ピリミドン光生成物のそれよりも嵩張らないため、XPC-RAD23BがOzを認識することが困難だからである。

これまでに得られたデータから、ヒトのNEIL1とNTH1がOzの修復酵素として最も可能性が高いことがわかった。

これまでのデータでは、ヒトのNEIL1とNTH1がOzの修復酵素として最も可能性が高いと考えられています。 もし、塩基除去修復の前にOzの反対側の塩基がアデニン、グアニン、チミンのいずれかであった場合、その後の複製で遺伝情報が変化してしまう。 このように、ヒトのOGG1が8-oxoGを除去できるように、OzがCと対になっているオリゴヌクレオチドからOzを正確に除去できる未知の酵素が存在する可能性がある。

OzOzはDNAポリメラーゼによるDNA合成を阻害するのか

K-ras癌遺伝子など多くの重要なゲノム領域に存在する連続したグアニン(GG)は、酸化還元電位が低いため、単一のグアニンよりも容易に酸化されてしまいます。 高酸化条件下でGG配列が酸化されると、酸化されたグアニンが連続して存在することになる。 我々は以前、一本鎖および二本鎖DNAのGGの酸化によってIzIzが生成されることを報告したが、このIz分子が加水分解されると、連続した2つのOz分子（OzOz）が生成されることが示唆された。

我々の分析によると、DNAポリメラーゼκはOzOzの反対側のヌクレオチドを取り込むことはありませんでした。

解析の結果、DNAポリメラーゼκはOzOzの反対側のヌクレオチドを取り込まず、Klenow fragment exoはOzOzの3′Ozの反対側のアデニンを優先的に取り込み、REV1はシトシンを取り込み、DNAポリメラーゼβはグアニンを取り込みました。 DNAポリメラーゼαは，グアニン，アデニン，シトシンをOzOzの3′Oz病変の反対側に取り込んだが，グアニンはアデニンやシトシンよりも容易に取り込まれた。 DNAポリメラーゼιは，グアニン，アデニン，チミンをわずかに取り込んだ。

これに対して、DNAポリメラーゼηは、OzOz病変を越えてプライマーを完全な長さまで伸長させたが、シクロブタンピリミジン二量体病変を越えた場合に比べて、その効率は控えめで、ほとんどのDNA鎖の合成はOzOzの3′または5′Ozで停止していた。 一方、DNAポリメラーゼζは、OzOzを越えてプライマーを完全な長さまで効率的に伸長させることができた。このことから、DNAポリメラーゼζは、単一のOz分子と連続したOz分子の両方を越えたトランスレッション合成に重要な酵素であることが示唆された。

四重鎖DNAの光酸化

テロメアのようなグアニンに富んだ配列は、四重鎖構造を形成することがある。 二本鎖DNAでは、連続したグアニン配列のグアニンの一電子酸化は、最高被占分子軌道（HOMO）の局在に依存します。 二本鎖DNAとは異なり、四重鎖DNAではd(TGGGGT)の3′-グアニンが主に酸化され、推定されるHOMOは3′-グアニンに局在している（図4b）。 二本鎖DNAと四重鎖DNAに関する現在の理解からすると、グアニンの選択的な一電子酸化は、DNAの構造に関わらず、局在化したHOMOで起こると考えられます。

一方で、グアニンの酸化生成物はDNAの構造に依存します。 例えば、一本鎖DNAではIzが主要な生成物であるのに対し、四重鎖DNAでは8-oxoGやデヒドログアニジノヒダントイン(Ghox)が主に生成される。 Iz、8-oxoG、Ghox、Ghは二本鎖DNAで形成され、一本鎖や四重鎖DNAでも主要な酸化生成物となる。

一本鎖、二本鎖、四重鎖DNAにおけるグアニンの酸化のメカニズムは次のように説明できる。 グアニンの1電子酸化により、グアニンラジカルカチオン（G-+）が生成され、その後、2つの分解経路を経る（図5）。 1つの経路では、G-+はN1位で脱プロトン化され、続いてIzが生成される。 もう1つの経路では、G-+が水和して脱プロトン化し、8-oxoG、Ghox、Ghが生成される。 四重鎖DNAでは、G-+のN1プロトンとグアニンのO6との間に水素結合があり（Fig.6a）、二重鎖DNAでは、G-+のN1プロトンとシトシンのN3との間に水素結合が形成される（Fig.6b）。 したがって、G-+の脱プロトン化は、四重鎖DNAでは著しく阻害され、二重鎖DNAでは部分的に阻害される。 一本鎖DNA > 二本鎖DNA > 四重鎖DNA の順に脱プロトン化しやすくなると推定され、この順がDNA構造の種類による酸化生成物の違いを説明している。