DISCUSSION

RT-PCR法などを用いた核酸増幅法は、ウイルス培養法などの以前から利用されている技術よりも、EV髄膜炎のより正確な診断を可能にします。 このような高感度な診断技術が利用できるようになったことで、現在では多くの髄液検体がEV核酸検査に提出されている。 我々は、当研究所で使用しているEV RT-PCRの性能評価に役立てるために、白血球数やタンパク質レベルなどのCSFプロファイルをモニターしてきた。 今回、2001年から2003年の3年間にEV RT-PCRに提出された検体のデータを分析し、CSFパラメータと中枢神経系（CNS）へのEV感染の有無との関係を再確認した。 そのうちの1年は，当地でWNVが大発生した年であり，別の神経栄養性病原体の存在が，CSFプロファイルの異常とEV RT-PCRの存在の可能性との関係に与える影響を評価することができた。

我々の研究の主な焦点は、CSFの白血球数とEV RT-PCRの結果との関係でした。 我々は、EV CNS感染とCSF白血球数の上昇の両方を有する患者の割合を決定することに興味がありました。 また、CSF白血球数が上昇した患者のうち、EV感染が原因となった患者の割合を調べることも目的とした。 その結果、これらの割合はいずれも年齢に大きく影響されることがわかった。 EVのRNAが陽性のCSFサンプルにおいて、CSF白血球数の増加が認められなかったのは、主に生後2カ月未満の乳児に限られており、この年齢層では非常によく見られた（28％）が、これはおそらくこれらの患者の免疫学的な未熟さを反映していると思われる。 これらの患者では、感染部位への白血球の動員に必要なケモカイン反応がまだ発達していないのではないかと推測されます。 高齢の患者では、CNSにEVが感染した患者のうち、多量の細胞が見られなかったのは2％以下であった。 逆に、EVのRT-PCRが陰性でCSFに多量の細胞が見られるのは、高齢患者のサンプルでより一般的であった。

以前の小規模な研究でも、EV RT-PCRの結果とCSFのパラメータの比較に焦点を当てていました。 Henquellら(5)は、髄膜炎の症状を持つ61人の患者について、EVの培養とPCRの結果をCSFの所見と比較して報告しました。 61人中56人（92％）がPCR陽性であったが、>1.5歳の9人の患者はCSFの細胞数が<10個/mm3で、PCRまたは培養が陽性であったという。 したがって、彼らの研究では、胸水細胞数とEVのRT-PCR陽性との相関は良くなかった。 Böttnerら（2）は、2000年の夏に髄膜炎の症状を呈した70人の患者のコホートについて報告しています。 その研究では、CSFのEV RT-PCRアッセイ61件のうち29件（46％）が陽性であった。 CSFの細胞数は2〜1,820個/mm3で、平均は151個であった。 著者らは、EV RT-PCR陽性の患者と陰性の患者との間で、検査所見に違いはなかったと報告しているが、詳細なCSF細胞数は示されていない。

本研究の興味深い点の1つは、EV RT-PCRアッセイが陰性の患者におけるCSF多血症の原因に注目していることです。 考えられる説明としては、アッセイがすべてのEV感染を検出できない可能性があります。 我々は、低レベルのウイルスRNAを検出する能力という点で、Chemicon社のアッセイの実際の分析（分子）感度を知らない。 感度を調べたところ、50%組織培養感染量の2.0倍のオーダーであることがわかりましたが、これがどれだけのEVゲノムを表しているのか、また、ヒトCSFの急性感染でどれだけの非感染性粒子が生成されるのかはわかりませんでした。 しかし、我々の研究では、生後2カ月以下の148人中21人（14％）、生後2カ月の549人中169人（31％）が胸水を認め、EVのRT-PCRが陰性であったことから、これが唯一の説明であるとは考えられない。 今回使用したプライマーとプローブは，ヒトに感染する既知の64種類のEVのうち，6種類を除くすべてのEVを検出することが示されている(13)． 1つのEV，コクサッキーウイルスA15は検査に使用できず，このプライマーとプローブの組み合わせで検出されなかった他の2つのEV，エコーウイルス22と23は，その後，パレコウイルスに再分類された（16）。 検出されなかった6つのEVは、疫学的にまれなものである。 HSV，EBV，WNVなどの他の感染症は，胸水症の患者の一部で診断されたが，2002年に胸水症を発症し，EV RT-PCRが陰性であった本研究の全患者（n＝77）の23％にあたる18件の感染にとどまった． 残りの患者の中には、パレコウイルスなどの他の感染体に感染していた可能性がある（16）。 さらに，この研究で観察された胸水腫の症例の一部は，コトリモキサゾール，非ステロイド性抗炎症薬，静脈内免疫グロブリンなどの薬剤に対する反応を含む，非感染性の胸水腫の原因であった可能性があります。

EVのRT-PCR陽性の指標として、CSFタンパク質レベルを使用することが検討されました。

EV RT-PCR陽性の指標としてCSFタンパク質レベルの使用が検討されましたが、データは、CSFタンパク質レベルを単独で使用した場合には感度も特異性もなく、また、胸水細胞症と併用した場合には感度や特異性を高めないことを示していました。 受信者動作特性曲線によると、CSF蛋白質レベル単独では、調査したどのカットオフレベルでも80％以上の特異性を示すことはなく、年齢層や調査した3つのレベルのいずれにおいても、感度と特異性の両方が80％以上になることはありませんでした。

2002年のEVシーズンに地域社会でWNVが流行していたことは、CSFマーカーをEV RT-PCR陽性の相関関係として使用する際の交絡因子となる可能性がありました。 実際、表33のz検定データは、おそらく2002年のシーズン中にセントルイスでWNVが発生したことが原因で、EV RT-PCR陽性の相関として、多量体細胞のみ、または多量体細胞および/またはタンパク質レベルの上昇の特異性について、2001年と2002年のシーズンのデータ間に有意差があったことを確認しています。 2002年には、>生後2か月の患者からのCSF検体のうち、胸水があってEV PCRが陰性だったものが67例あった。 このうち、10人（15％）がWNVに陽性で、18人（27％）がWNVまたは他のウイルスのいずれかに陽性でした。 2002年の計算からこれら18人の偽陽性をすべて取り除くと、特異度とPPVはそれぞれ56％と23％から63％と29％に増加しました。 2001年に>生後2カ月の患者から採取されたすべての検体の特異度とPPVは、それぞれ62％と66％であった。 他のウイルスの存在に起因する偽陽性を除去しても、2001年から2002年へのPPVの低下を説明することはできません。 他の未知の要因が働いているに違いない。

EV感染以外のCSFプリーサイトーシスの原因に注目することに加えて、この研究の結果は2つの実用的な応用があります。 1つ目は、EVのRT-PCRを行っている検査室が、RT-PCRの結果とCSFの細胞数の比較を利用して、そのアッセイの品質保証プログラムの一部として使用できる指標を開発できることです。 我々の経験に基づく1つの指標は、CSF多血症を有する生後2か月未満の乳児の約75％、CSF多血症を有する生後2か月から18歳までの乳児および小児の約65％、CSF多血症を有する18歳以上の患者の約25％において、EV RT-PCRが陽性であるべきであるというものです。 これらの数値は、WNVが発生しなかった、あるいはあまり発生しなかった2つのシーズンのデータを用いて算出されています。 髄膜炎を引き起こす可能性のある既知または新規のアルボウイルスやその他のウイルスが流通すると、EV RT-PCRの結果が陽性である胸水貯留患者の割合が減少するため、この基準に関連するデータの分析について考慮する必要があります。

品質管理に使用できる2つ目の指標は、EV RT-PCRアッセイは、CSF胸水腫を発症していない生後2ヶ月以上の患者の約98％、胸水腫を発症していない生後2ヶ月未満の患者の約70％が陰性でなければならないというものです。 胸水腫のない患者のより大きな割合でEV RNAが検出された場合、検査室はPCRによる汚染が存在するかどうかを検討する必要があります。

本研究で得られた知見の2つ目の実用的な応用例は、検査室がこのデータを利用して、EV RT-PCR検査の効率を最大化するための基準を確立することです。 例えば、胸水がない場合、生後2カ月以上の患者のRT-PCR結果が陰性であることの予測値が98％以上であることから、検査室は胸水の有無に基づいてEV RT-PCR検査のカットオフ値を設定することができます。 本研究のデータを用いると、このカットオフを適用した場合、549検体中223検体が除外されることになり（CSF細胞数が得られた>生後2カ月の患者からの549検体に基づく）、除外された223検体群に含まれていたであろう3つの陽性検体（1.3％）のみが検出できなかったことになる。 EVに感染したが胸水が出なかった3人の患者は、生後5カ月、10歳、15歳であった。 これらの患者のうち1人（10歳）は、首のこりからEV髄膜炎が疑われましたが、他の2人は髄膜炎との関連性がはっきりしない症状でした。 10歳の患者は、髄液中の多血小板症ではなく、臨床的にEVが疑われたために検査を受けたと思われるが、他の2人は検査を受けなかったかもしれない。 3例とも、EV PCR陽性の結果は症例管理に大きな影響を与えなかった。 私たちが提案したような対策を採用する場合は、生後2カ月以上の患者に適用し、EV感染が臨床的に強く疑われる個々の症例については、患者の年齢や髄液多量細胞症の有無にかかわらず、検査を可能にする仕組みを確保することを推奨します。 明らかに、CSF多血症に基づくスクリーニングプログラムは、スクリーニング基準を適用してもアッセイの実施を遅らせることのないように、CSF細胞数データへのアクセスが十分に迅速である検査室にとってのみ実用的である。 以前の研究では、臨床的な意思決定に影響を与えるためには、EVアッセイを非常にタイムリーに行う必要があることが明らかになっています(14)。