Results and Discussion

Mal d 1.0101の立体構造は、タンパク質のC末端にある長いらせん（α3）と、連続する2つの短いらせん（α1、α2）を含む、湾曲した7本の逆平行βシート（β1-β7）で構成されている（図図11）。 βシートの端は、β1とβ2で形成されており、α1とα2のヘリックスが、ヘリックスα3のC末端部分をV字型に支える形でつながっている。 PR-10ファミリーの他のタンパク質と同様、β2鎖とβ3鎖はグリシンリッチループモチーフ（Gly46-Asn47-Gly48-Gly49-Pro50-Gly51）で連結されており、これらの構造要素が、PR-10フォールドの典型的な構造である大きな内部空洞を形成している。 図11Bから明らかなように、Mal d 1のNMR構造アンサンブルでは、20個の構造モデルすべてにおいて、二次構造の要素が非常によく定義されており、コンフォメーション的にも均一であることがわかる。

PR-10フォールドの特徴として、内部に大きな空洞があることが挙げられます。Mal d 1.0101の空洞36の体積は約2230Å3で、これは他のPR-10タンパク質と同程度の大きさです。 ブドウ花粉アレルゲン「Bet v 1」や他の同種の食物アレルゲンに見られるように、Mal d 1では、空洞の表面を形成するアミノ酸の大部分が疎水性である（図図22）。 内部空洞の表面の大部分は、疎水性側鎖がタンパク質内部に位置するβシートのアミノ酸残基によって形成されている（Ile56（β3）、Val67（β4）、Ile71（β4）、Tyr81（β5）、Tyr83（β5）、Leu85（β5）、Ile98（β6）、Tyr100（β6）、Tyr100（β6）、Leu85（β5）、Ile98（β6））。 また、両親媒性の長いヘリックスα3（Val132, Val134, Ala139, Leu142, Phe143, Ile146）、2つの短いヘリックスα1（Phe22, Val23）とα3（Ala26, Ile30）、ループ領域（Ile38, Phe58, Tyr64, Ala90）にも内向きの残基が存在している。 さらに、Asp27(α2)、His69(β4)、Ser115(β7)、Lys138(α3)など、いくつかの極性および荷電側鎖が分子の内側に位置し、空洞の表面の一部を形成しているため、主要なバーチ花粉アレルゲンであるBet v 1について前述したように、空洞自体が実際に両親媒性である37。

(A) Mal d 1の内部空洞。0101、MOE32で実装されている親油性ポテンシャルに従って着色されており、親水性の領域は青、親油性の領域は黄色に着色されている。 (B) Mal d 1.0101の最もエネルギーの低い溶存構造の表面表現。 内部空洞への2つの両親媒性の入り口は、ε1（ヘリックスα3のN末端と、ストランドβ3-β4およびβ5-β6をつなぐループの間）およびε2（βシートの端とヘリックスα3のC末端の間）と示されている。

Mal d 1の内部空洞には、2つの入り口がある（図22）。 1つ目の入り口であるε1は、ヘリックスα3のN末端側の残基(His131, Val134)と、ストランドβ3-β4(Gln63, Tyr64)とストランドβ5-β6(Asp89)をつなぐループによって形成されています。 これらのアミノ酸は、タンパク質内部への両親媒性のアクセスルートを形成している。 もう一つの両親媒性の入り口ε2は、βシートの端にある、ヘリックスα3（Lys136, His140, Lys144, Glu147）とストランドβ1（Asn7, Phe9, Ser11）の間に存在する。 Mal d 1のNMR溶液構造では、このアクセスルートはHis140の側鎖によって部分的に妨げられている。 また、PR-10タンパク質ファミリーの他のメンバーについても、同様の位置に内部キャビティへの入り口があることが報告されている5

図33は、Mal d 1と、これまでに構造が決定されているBet v 1およびPR-10ファミリーのシラカバ花粉関連食物アレルゲンとの比較を示している。 Mal d 1と主要なカバノキ花粉アレルゲンであるBet v 1との間に観察された免疫学的な交差反応性を考慮すると、この2つのタンパク質の構造比較は特に興味深いものである。 Mal d 1.0101とシラカバ花粉アレルゲンの高アレルゲンアイソフォームBet v 1.0101（配列同一性61％）との間のbackbonermsdは2.13Å（二次構造要素は1.70Å）である。 注目すべきは、Mal d 1とBet v 1の長さが1アミノ酸違い、Mal d 1のギャップの位置については様々な推定がなされていることである。 PR-10食物アレルゲンの配列調整に基づいて、Mal d 1では、鎖β7の直前39,40または直後4,34,41,42のループが1残基短いと提案されている。 我々の解答構造は、β7鎖の直前のループが、Mal d 1.0101で短くなっていることを示している。 β6鎖（Mal d 1.0101とBet v 1.0101の両方でGlu96-Val105）とβ7鎖（Mal d 1.0101ではSer111-Thr121、Bet v 1.0101ではSer112-Thr122）は、これらのタンパク質の反平行βシートの中で、同じ位置にあり、同じ水素結合パターンを持っている。

PR-10食物・植物アレルゲンと既知の構造との比較 (A) Mal d 1.0101の最もエネルギーの低い構造の重ね合わせ (緑、PDB accession)。0101（緑、PDB accession code 5MMU）の最低エネルギー構造と、主要なカバノキ花粉アレルゲンBet v 1.0101（青、4A88）、ニンジンアレルゲンDau c 1.0103（オレンジ、2WQL）、セロリアレルゲンApi g 1.0101（灰色、2BK0）、大豆アレルゲンGlym 4.0101（黄色、2K7H）、イチゴアレルゲンFra a 1E（赤、2LPX）、サクラアレルゲンPru av 1.0101（紫、1E09）。 B）Clustal Omegaを用いて得られたこれらのアレルゲンのマルチプルシークエンス・アラインメント。53 アミノ酸はアスタリスク（同一）、コロン（保存）、ドット（半保存）で示されている。

Mal d 1はシステインを介した二量体化の傾向があることが知られており、非還元性ゲル電気泳動やサイズ排除クロマトグラフィーによってMal d 1.0108のアイソフォームが示されている35。 Mal d 1.0101の3次元溶液構造では、Cys107はβ7鎖のC末端側に位置し、その側鎖はタンパク質の表面に向けられていた。 NMR構造解析に用いた条件（pH6.9、10mMリン酸ナトリウム、14mol当量のl-アスコルビン酸、298K）で、Mal d 1.0101のオリゴマー化状態を調べるために、パルスド-フィールドグラジエントNMR拡散実験を行った。 その結果、Mal d 1.0101の流体力学的半径は21.6±0.8Åであり、同様の実験条件で得られたBet v1.0101の流体力学的半径（20.1Å）と同程度であった21。これは、同じ緩衝液を用いたサイズ排除カラムで、Mal d 1.0101がBet v1.0101とほぼ同じ保持時間で溶出するという観察結果と一致する。

Mal d 1のNMR溶液構造から、このタンパク質は高度に湾曲した逆平行βシートと3つのα-へリックスからなり、大きな内部空洞を形成していることがわかった5。 これは、Mal d 1と主要なカバノキ花粉アレルゲンであるBet v 1、およびPR-10タンパク質ファミリーの他の食物アレルゲンとの間に観察された免疫学的交差反応と一致している4,43。 多くの患者ではBet v 1が感作物質となり、Bet v 1特異的IgE抗体がMal d 1と交差反応してアレルギー反応を引き起こすことがわかっている。

また、リンゴアレルギー患者のMal d 1を用いた交差阻害実験では、Mal d 1が主要なカバノキ花粉アレルゲンであるBet v 1とIgEエピトープを共有していることが示された4,43。構造的な観点からは、Mal d 1とBet v 1の結合エピトープの正確な性質に関する情報は限られている。 連続して不連続な（すなわち、コンフォメーションの）B細胞エピトープに関する詳細な構造情報は Bet v 1のB細胞エピトープについての詳細な構造情報は、Bet v 1.0112という特殊なアイソフォームを、ネズミのモノクローナルIgG抗体BV16由来の抗原結合フラグメント（Fab）と共結晶させることで得られた。45 このエピトープは、Bet v 1のGlu42とThr52の間のセグメント（β2鎖とβ3鎖の間のグリシンリッチループモチーフを含む）、Arg70、Asp72、His76、Ile86、Lys97によって形成されており、タンパク質表面全体の約10%（約900Å2）を占めている。 このエピトープにBV16を結合させると、血清IgEとの相互作用が著しく低下することから、IgEとモノクローナルIgG BV16がBet v 1の重複する結合面を争っていることがわかった46。 Mal d 1では、これらの残基は、Bet v 1のBV16エピトープと形や大きさが似ている、やや遠位の残基（Glu76）とともに、連続した表面パッチを形成している。 さらに、これらのアミノ酸は、Mal d 1とBet v 1の間でほとんど保存されている。 BV16エピトープの16個のアミノ酸のうち13個が同じであるのに対し、Mal d 1.0101とBet v 1.0101では3つの残基しか異なっていない（図44B）。 これらのデータは、カバノキ花粉とリンゴアレルゲンの間に観察されるアレルギー交差反応の構造的な根拠を示すものである。 興味深いことに、Mal d 1のBV16エピトープとBet v 1のエピトープの類似性を高めることで、Mal d 1のシラカバ花粉アレルギー患者の血清IgEとの結合能力が高まることが変異研究で示されており、これらのアミノ酸が実際にMal d 1に特異的なBet v 1の結合に関与していることがわかる。39

(A) Mal d 1のコンフォーメーションエピトープ。 モノクローナルIgG BV16とBet v 1.0112の分子間相互作用面に対応するアミノ酸残基（Mal d 1.0101のGlu42-Thr52、Arg70、Asp72、Glu76、Ile86、Lys97の残基）を青で着色した45。 (B) Bet v 1.0101とMal d 1.0101の間のアミノ酸の類似性を、ライラック色（高度に類似）からティール色（高度に非類似）への色調の変化で示した。 Bet v 1.0101とMal d 1.0101の間で異なるエピトープ残基にはラベルが付けられている。 類似性は、MOEに実装されている置換行列スコア(BLOSUM62)に基づいて計算された32

Mal d 1には1つ以上のコンフォメーションエピトープが存在すると考えられます。 リンゴアレルギー患者を対象としたスキンプリックテストでは、野生型Mal d 1と5点変異型Mal d 1を比較したところ、in vivoでの皮膚反応に対する変異型タンパク質の能力が著しく低いことが示された48。 これらの5つのアミノ酸は、Mal d 1だけでなく、Bet v 1のIgEとの相互作用にも関与していると考えられることから、これら2つのアレルゲンに共通する交差反応エピトープの一部である可能性がある49。 さらに、別の研究では、Ser111がIgEのMal d 1への結合に必須であることが確認され、Ser111→Cysの変異により、イムノブロッティング実験でIgEへの親和性が著しく低下した13。

図44Aは、これら6つの残基がMal d 1のタンパク質表面にかなり分散しており、これらのアミノ酸はいずれもBV16のエピトープとは重ならないことを示している。 また、Thr10、Ser111、Thr112はタンパク質表面で共通のパッチを形成しているが、Thr57は約37-39Å離れたBV16エピトープの近くに位置している。 典型的なサイズ（約600～900Å2）39で円形のエピトープは、Mal d 1の表面上で28～34Åの弧を描くことを考えると、Thr10、Ser111、Thr112の各残基はThr57から離れすぎていて、共通の結合エピトープの一部にはならないと考えられる。 残りの2つの残基、Ile30とIle113は、Mal d 1ではタンパク質の表面に到達していない。 Ile113は、空間的にはThr10-Ser111-Thr112パッチに近接しているが、その疎水性サイドチェーンはタンパク質の内部に向いており、タンパク質の空洞の内端（ヘリックスα1、α3とβシートの間）にある小さな疎水性コアに参加している。

なお、β6とβ7の間のループは、Mal d 1の方がBet v 1よりも1残基短いため、Mal d 1のβ7のSer111とThr112は、Bet v 1のSer112とIle113のβ7の位置を占めています。 Mal d 1のThr10、Ser111、Thr112で形成される表面パッチは、Bet v 1の対応する表面パッチ（Thr10、Ser112、Ile113）よりも疎水性が低いようだ。 実際、図44Bに示されているように、Mal d 1.0101とBet v 1.0101の間では、これらの3つの残基を取り囲むタンパク質表面の類似性が他の部分よりもかなり低いことがわかった。 一方、Bet v 1とMal d 1の間のエピトープ適合率は限られている可能性が指摘されており47、最近の研究では、Bet v 1に結合するヒトIgEが分離されたが、Mal d 1には結合しなかったことが示されている。

高分解能の構造データは、アレルゲンタンパク質の（交差反応性）結合エピトープの構造的詳細を決定し、比較するための基礎となることは明らかです。

高解像度の構造データは、アレルゲンタンパク質の（交差反応性のある）結合エピトープの構造的詳細を決定し、比較するための基礎となることは明らかです。 エピトープグラフト法を用いて、Mal d 1のBV16エピトープをMal d 1の表面に再現することで、Mal d 1のBV16エピトープの役割を明らかにし、IgE結合やBet v 1との交差反応に重要であることを確認した。また、Bet v 1とMal d 1のキメラを作製し、ファージライブラリから分離したヒトモノクローナルIgEのエピトープをBet v 1のC末端にマッピングした50。51 また、エピトープグラフト法は、IgE結合能の低下など、抗原性を微調整したキメラアレルゲンを利用することができ、分子ベースのアレルギー診断や特異的免疫療法が可能になる52。 今回発表したMal d 1.0101の三次元構造は、免疫学的交差反応の分子的詳細を解明するための生物物理学的基盤を提供するものである

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