DISCUSSION

本研究では、Hbと、5-kDのPEGを2コピーまたは6～7コピー結合させたHbのSAXS溶液構造を発表しました。 これは、低解像度ではありますが、PEGを結合したヘモグロビンの3次元構造決定の最初の例です。 本研究で得られた最も重要な知見は以下の通りである。 i) PEGの結合は、（この解像度では）Hbの三次構造に大きな歪みをもたらさないが、四次構造は圧縮されているように見える。 ii) PEG鎖の一部はHbサブユニット間の空洞に入り込み、一部はタンパク質の表面近くに留まり、残りは表面から突出している。 iii) PEG化により、球状のHb分子が、2つまたは6つのPEGが結合した細長い構造に変化する。 iv) PEG結合により、タンパク質Hbを取り囲むPEG層に起因するPEG化されたHb分子間の反発が生じ、これはSAXSデータに顕著な濃度効果として現れた。

実験的に得られたHbの散乱は、オキシHbの結晶構造から計算された曲線とよく一致しましたが、デオキシHbの結晶構造では、より悪いフィット感が得られました。 P5K2もP5K6も、近位のHis-β92に隣接するCys-β93に共役している。このCys-β93は、Hbのβサブユニットの中で唯一、ヘム鉄に直接配位している残基である。 5kDのPEGが結合すると、βサブユニットのヘムポケットに、この分解能（約12Å）では検出できないような局所的で小さな構造的歪みが生じると考えられる。 このことは、P5K6のβサブユニットのヘム消失速度が非共役Hbと比較して5倍高いこと、一方、αサブユニットはHbと同程度の速度を示すことからも裏付けられる(8)。 この解釈と一致するように、今回研究したP5K6と化学構造が似ているPEG結合型Hbの1H NMR研究では、β-サブユニットの近位ヒスチジンにシフトが見られたが、α-サブユニットには見られなかった(28)。

N-エチルマレイミドによるCys-β93残基の修飾のみでは協同性が失われ、この効果は4元構造の圧縮とともに、Hemospanの協同性が明らかに失われたことを説明していると考えられる(5)。 四分子の動きが制限され、R状態とT状態の間の部分的な移行のみ、あるいは中間的な四分子構造が生じる可能性がある。

HbとPEG-Hbの広角部分の散乱が一致していることから、PEG化による3次/2次構造の変化は考えられませんが、今回の結果はPEG化されたタンパク質のよりコンパクトな4次構造を示しています。 これは、予想外にPEG-Hbsの内部に部分的に存在するPEG鎖によって、サブユニット間の界面が部分的に脱水されたことで説明できる。 オキシHbの4元構造は、ヘモグロビンの4つのサブユニットの間に中央の空洞を作っている。 オキシHbの高分解能結晶構造(27)に示されているように、この空洞は少なくとも80個の水分子を収容することができる。 したがって、PEGがサブユニット間の界面に入り込み、4量体の内部にある水分子を置換するのに十分な体積がある。 また、PEGは脱水を起こすことが知られており、タンパク質の結晶化の際に共溶媒として用いられることが多い。 中央の空洞に存在する水分子の変位と併せて、一般的な脱水がPEG-Hbsのコンパクトな四元構造に寄与しているのかもしれない。

PEG鎖の大部分がHbの外側に位置していることから、今回の結果は、PEGが立体障害によってタンパク質から優先的に排除されるという初期の研究結果と一致しています(32)。 さらに、排除力と競合する形で、PEGは非極性タンパク質表面の残基と相互作用することが示されており(32)、5kDのPEGがシトクロムc表面の疎水性クラスターと相互作用することが報告されている(33)。 Hbの疎水性スコアはKyte and Doolittle (34) に従って計算され（図6）、らせん状のセグメントに並んだ残基番号が示された。 PEG-Hb間の相互作用で特に注目すべき領域は，二量体間のα1β1パッキングコンタクトにおける比較的疎水性の高いG-Hヘリックス上である。 我々のモデルは、PEGとHbの表面相互作用を示しているが、関係するHbの残基やその極性を定義するには解像度が不十分である。 比較的高いタンパク質濃度で記録したSAXSスペクトルを解析すると、P5K2とP5K6の両方で明確な濃度効果が見られたが、非共役Hbではこの効果はほとんど見られなかった。 予想通り，P5K2よりもP5K6の方が濃度効果が顕著であることから，追加のPEG鎖を導入することでHb分子の遮蔽性が向上することが示唆され，理論的なPEG共役Hbの分子動力学計算とも一致した（31）。

直感的には、PEG-Hbsは非PEG化Hbと同じ形をしていると予想されますが、ここでは、PEG化タンパク質の形はコアタンパク質の形によって定義されるものではないことを示しています。 PEG-Hbsの非球形の溶液形状は予想外であり、ストークス-アインシュタイン方程式を用いてPEG-Hbの拡散定数を計算するための新たな情報となる。 我々は、PEG-Hbを含む無細胞Hbによる酸素輸送のシミュレーションを報告しており、Hbの分子拡散が全体の酸素輸送における重要な要因の一つであることを示した（35）。 この結論は正しいのですが、この研究では、Hb分子が球状であるという単純化された仮定を用いています。

さらに、P5K2とP5K6はどちらも似たような形状と全体的な寸法を持っていますが、溶液中の粒子の反発効果の違いにより、生体内でのPEG化されたHbのポジティブな効果の一部を説明することができる非常に重要な特性が得られました。 これらの観察結果の一般性は、結合したPEG鎖に起因するものであり、濃度効果はPEG結合の一般的な結果であることを示唆している。

血管内滞留時間の延長、免疫原性の低下、溶解性の向上など、いくつかの一般的な利点は、PEGポリマーのタンパク質への結合によく関連しています。 例えば、インターフェロン-β-1bに40kDaの分岐型PEGポリマーを結合させると、循環半減期が非結合型の1.1時間からPEG結合型の9.4時間へと顕著に改善し、さらにPEGの結合によりタンパク質の免疫原性と凝集傾向が劇的に減少した(4)。 PEG-Hbが他のタンパク質や細胞を排除する能力は、酸素治療薬の設計において特に重要である。 ヘモグロビンをベースとした製品は、毒性を最小化または排除しつつ、循環時間を延長するように最適化されています。 この結果は、未修飾の無細胞Hbの非常に速い腎クリアランスと比較して、ヘモグロビン尿がない場合(14)、Hemospanの循環半減期が約20時間と延長されていることと一致しています(36)。 ヘモスパンの循環時間が長くなるのは、マクロファージのCD163受容体にヘモスパンが結合しないためと考えられる。 現在、このシステムでのHemospanの研究が進行中である。 さらに、PEG-Hbが他の免疫細胞から排除されることは、炎症反応を避けるために重要であると考えられる。 無細胞ヘモグロビンによる血管収縮についての有力な理論は、Hb分子が内皮に接近する（38）、または内皮を越えて滲出する（39）というものであり、いずれの場合もNO消去がより効率的になり、その結果、血管の緊張が高まり、高血圧や灌流低下といった負の副作用が生じると考えられている（40）。

今回の小角散乱分析から得られた新たな知見は、反発効果が最大または最適になるようにPEG-Hbsを設計したり、粒子径やPEGのコンフォメーションを調整する際に利用できます。 分子間反発力は、同じポリマー長の共役PEGの総質量に応じて大幅に増加し（P5K2とP5K6では10kD対約30kD）、この効果は分子の形状や寸法の変化では予測できなかった。

PEGの有効長はFlory次元（RF）で定義され、これはオキシエチレン単位の有効長a = 3.

RFの相対的な寸法と表面上のPEGグラフト部位DG間の距離により、グラフトされたPEGポリマーの二次構造が決定される。 DG > RFの場合、PEGポリマーはグラフト表面上でそれ自体に折り畳まれることができ、「マッシュルーム」コンフォメーションを形成し、DG < RFの場合、PEG鎖間の立体的な相互作用によってPEGは伸長し、「ブラシ」コンフォメーションを形成し、DG≈RFの場合、PEGは「マッシュルームからブラシ」への移行段階にある(45)。 5kD PEGの場合、N = 113、RF ∼ 60 Åである。Hb表面の一方のCys-β93から対称的に反対側の他方のCys-β93までの半最大円周DGは∼110 Åであるため、DG > RFとなり、P5K2にグラフトしたPEGポリマーのマッシュルーム型コンフォメーションが可能となる。 これは、P5K2のSAXS構造から得られるPEGの特徴に反映されており、Dmax=115Åの全体的な楕円形を示している。5kD PEGのFlory次元を用いてP5K2の最大直径を計算すると、Dmax∼190Åの分子が得られる（すなわち。

より高度にPEGを配位させたP5K6分子は、2つの特異的な結合部位（Cys-β93）に加えて、さらに4～5つのPEGグラフト部位を持つ。 SAXS溶液構造から、P5K6のPEG鎖はP5K2に比べて立体的な相互作用が大きく、さらに細長い形状を形成していることが示唆された（図4）。 PEG鎖がHbの表面上に均一に分布しているという近似を用いると、DGは約55Åに減少し、DG≒RFとなり、PEGのコンフォメーションはより伸長しているが、依然としてマッシュルームからブラシへの移行期にあることが示唆された。 測定されたDmax=130Åと比較して最大フローリー寸法を用いると、P5K6の5kD PEG鎖は完全なフローリー寸法の約70%まで折り畳まれているように見え、P5K2と比較してP5K6では立体的な制約によりPEGの伸長が増加していることと一致します。

SAXSによる粒子径の直接測定とフローリー解析を組み合わせることで、P5K6はマッシュルームブラシ型の転移をしており、したがって、共役PEGが完全に伸長したときに最大の粒子径になるようには設計されていないことを予測しました。 新しいPEG-Hb分子は、DG < RFが以下のいずれかの方法で、より大きな粒子になるように設計することができます。 1) より多くのPEG付着部位を持つ、より高度に共役したHbを作ることでDGを減少させる、または2) PEGの長さを増加させることでRFを増加させる。 PEGのサイズを10kDに2倍にすると（すなわち、P10Kx（xは結合部位の数））、RFは約90Åに増加し、P10K2ではマッシュルームコンフォメーションになるが、P10K6ではより完全なブラシコンフォメーションに近づくと予測される。 しかし、PEGポリマーの長さを延ばすことで、PEG-Hbの化学結合反応における立体的な相互作用がどのように変化するかは不明であり、新しいデザインでは、マッシュルームからブラシへの転移点を確認するために、SAXS研究と合わせて反応比を実験的に検討する必要があります。