Cardellini recebeu o seu primeiro grande papel em 1996, quando conseguiu um papel de estrela como Sarah na série infantil de acção ao vivo de sábado de manhã da ABC, Bone Chillers. Depois disto, ela fez aparições convidadas em programas de horário nobre como Step by Step, Clueless, 3rd Rock from the Sun, e Boy Meets World como Lauren, uma rapariga que se meteu entre o casal de estrelas do espectáculo. Cardellini estrelou na primeira temporada da série AMC The Lot, em 1999, e passou o Verão na Europa como parte de uma produção itinerante de Lancelot, uma tragédia holandesa do século XIV.
Cardellini teve o seu primeiro grande sucesso quando conseguiu um dos papéis principais na série NBC Freaks and Geeks, que estreou durante a temporada 1999-2000. Como Lindsay Weir, uma estudante de honra no meio de uma crise de identidade, Cardellini obteve uma resposta positiva que subsequentemente a catapultou para a fama. Cardellini estrelou na adaptação de acção ao vivo de Scooby-Doo em 2002, na qual interpretou a personagem de desenhos animados Velma Dinkley. Mais tarde, ela repreendeu o papel de Velma na obra Scooby-Doo 2: Monsters Unleashed de 2004. Juntou-se ao elenco do drama hospitalar ER em 2003 como Samantha Taggart, uma enfermeira de espírito livre. Cardellini actuou durante seis temporadas nas ER, até ao final da série, “And in the End…”, e com o elenco ganhou o prémio Ícone do conjunto de TV Land em 2009.
Os seus outros trabalhos cinematográficos incluem papéis em Dead Man on Campus, Strangeland, Good Burger, Legally Blonde, Brokeback Mountain (para o qual foi nomeada para os prémios do conjunto Gotham e Screen Actors Guild), e um papel de protagonista no filme Happy Madison’s Boy as Samantha. Ela foi a voz de Ursula no jogo de role-playing, Gladius, e interpretou a voz de Bliss Goode na série animada ABC The Goode Family. Em 2007, Cardellini foi escolhida para interpretar Clara, a amorosa Clara, na minissérie Comanche Moon da CBS, uma prequela da Lonesome Dove.
Em 2010 e 2011, Cardellini voltou ao palco com o grupo de comédia Dr. God em Los Angeles e São Francisco, apareceu em Kill the Irishman e Super, e estrelou no filme independente Return. Ela apareceu com membros do elenco e produtores de Freaks e Geeks e Undeclared no Paley Center for Media PaleyFest a 12 de Março de 2011. De 15 de Junho de 2012 a 15 de Fevereiro de 2016, ela foi a voz de Wendy no programa do canal Disney Gravity Falls.
A voz deCardellini actua periodicamente no podcast e no programa ao vivo The Thrilling Adventure Hour, no Sparks Nevada: Marechal, nos segmentos de Marte. Em 2013, foi escolhida para interpretar Sylvia Rosen, um interesse amoroso de Don Draper no Mad Men. Pela sua actuação no Mad Men, recebeu uma nomeação para o prémio Primetime Emmy Award for Outstanding Guest Actress in a Drama Series. A partir de 2015, juntou-se a Kyle Chandler numa nova série dramática da Netflix Bloodline, dos criadores da série Damages. O espectáculo foi cancelado em 2016, e terminou após a sua terceira temporada. Nesse mesmo ano, teve também um papel de protagonista como Sara Whitaker no filme de comédia Daddy’s Home. Em 2017, ela repreendeu o seu papel no filme sequel Daddy’s Home 2.
Em Agosto de 2018, Cardellini foi elenco para co-estrela com Christina Applegate na série de comédia negra Dead to Me de Netflix. Estreou a 3 de Maio de 2019. Pela sua actuação, recebeu aclamação da crítica e uma nomeação para o Prémio Primetime Emmy para Actriz Principal de Destaque numa Série de Comédia.
Em 2019, estrelou o filme de terror The Curse of La Llorona.