Introdução

Interferência do RNAi (RNAi) é um mecanismo regulador da maioria das células eucarióticas que utiliza pequenas moléculas de RNA de dupla cadeia (dsRNA) como estímulos para o controlo directo da actividade genética dependente de homólogos (Figura 1) (1). Conhecidas como pequenos RNA interferentes (siRNA), estas ∼21-22 bp moléculas de dsRNA longo têm características 2 nt 3′ overhangs que permitem o seu reconhecimento pela maquinaria enzimática do RNAi, o que eventualmente leva à degradação homóloga dependente do mRNA alvo. Nas células de mamíferos, os siRNAs são produzidos a partir da clivagem de precursores de dsRNA mais longos pelo Dicer de endonuclease RNase III (2), ou podem ser sintetizados por métodos químicos ou bioquímicos. O dicer é complexado com proteínas de ligação ao RNA, a proteína de ligação ao TAR-RNA (TRBP), PACT, e Ago-2, que estão envolvidas na entrega de siRNAs ao complexo de silenciamento induzido pelo RNA (RISC) (3). Os componentes centrais do RISC são os membros da família Argonaute (Ago). Nos humanos existem oito membros desta família mas apenas o Ago-2 possui um domínio catalítico activo para a actividade de clivagem (4,5). Enquanto os siRNAs carregados em RISC são de dupla cadeia, os Ago-2 clivam e libertam o cordão “passageiro”, levando a uma forma activada de RISC com uma molécula “guia” de RNA de cadeia única que dirige a especificidade do reconhecimento do alvo por emparelhamento de base intermolecular (6). As regras que governam a selectividade da carga de cordão em RISC baseiam-se em estabilidades termodinâmicas diferenciais das extremidades dos siRNAs (7,8). A extremidade menos termodinamicamente estável é favorecida para ligação ao domínio PIWI de Ago-2.

MicroRNAs

Um importante braço do RNAi envolve os microRNAs (miRNAs). Estes são dúplexos endógenos que regulam a expressão genética pós-transcrição através de complexação com RISC e ligação às regiões não traduzidas (UTRs) de sequências alvo através de pequenos trechos de homologia, denominadas “sequências de sementes” (9,10). O principal mecanismo de acção dos miRNAs é a repressão translacional, embora esta possa ser acompanhada pela degradação da mensagem (11). Os duplexes miRNA possuem emparelhamento de base Watson-Crick incompleto, e a vertente antisense não pode ser escolhida por clivagem da vertente passageiro como é para os siRNAs; por conseguinte, a vertente antisense deve ser escolhida por um mecanismo alternativo (12-14). os miRNAs são substratos endógenos para a maquinaria do RNAi. São inicialmente expressos como transcrições primárias longas (pri-miRNAs), que são processados dentro do núcleo em grampos de cabelo de 60-70 bp pelo complexo do microprocessador, consistindo de Drosha e DGCR8 (15,16) em prémiRNAs. Os prémiRNAs são processados no citoplasma por Dicer e um dos dois fios é carregado no RISC, presumivelmente através da interacção com uma das proteínas acessórias de Dicer (3). É importante notar que é possível explorar esta via de silenciamento de genes nativos para a regulação do(s) gene(s) escolhido(s). Se o efeito siRNA for entregue à célula, “activará” o RISC, resultando num silenciamento potente e específico do mRNA visado. Devido à potência e selectividade do RNAi, tornou-se a metodologia de escolha para silenciar a expressão genética específica em células de mamíferos.

RNAi como Abordagem Terapêutica para o Tratamento da Doença

Controlo dos genes associados à doença torna o RNAi uma escolha atractiva para a terapêutica futura. Basicamente, cada doença humana causada por actividade de um ou poucos genes deve ser passível de intervenção com base no RNAi. Esta lista inclui cancro, doenças auto-imunes, doenças genéticas dominantes, e infecções virais. O RNAi pode ser desencadeado por duas vias diferentes: (i) uma abordagem baseada no RNAi, em que os siRNAs efetores sintéticos são entregues por vários portadores a células alvo como duplex de 21 bases pré-formadas; ou (ii) através de estratégias baseadas no ADN, em que os siRNA efetores são produzidos por processamento intracelular de transcrições mais longas do fio de cabelo de RNAi (revistas nas Referências 17 e 18). Esta última abordagem é baseada principalmente na síntese nuclear de RNAs de citoplasma de cadeia curta (shRNAs), que são transportados para o citoplasma através da via de exportação do miRNA e são processados em siRNAs por Dicer. Embora a utilização directa de efectores de siRNA sintéticos seja simples e normalmente resulte num potente silenciamento genético, o efeito é transitório. Os medicamentos RNAi baseados em ADN, por outro lado, têm o potencial de serem introduzidos de forma estável quando utilizados num ambiente de terapia genética, permitindo, em princípio, um tratamento único dos genes do shRNA transmitido por vectores virais.

p>As primeiras aplicações clínicas do RNAi têm sido dirigidas ao tratamento da degeneração macular relacionada com a idade (DMRI), que causa cegueira ou visão limitada em milhões de adultos anualmente (19,20). As terapias baseadas no RNAi também estão actualmente a ser desenvolvidas para a infecção viral, incluindo o vírus da imunodeficiência humana (HIV), os vírus da hepatite B e C (HBV e HCV), e o vírus sincicial respiratório (RSV) (21). As estratégias para o tratamento de doenças neurodegenerativas e cancros estão também bem encaminhadas.p>Embora estudos in vivo bem sucedidos tenham demonstrado a eficácia potencial das terapias baseadas no RNAi, outros estudos ilustraram abordagens específicas a evitar quando se adopta um mecanismo celular endógeno para benefício terapêutico. Os efeitos secundários indesejados incluíram a activação de receptores tipo Toll-like (TLRs) e respostas de interferão de tipo 1, e competição com os componentes endógenos da via do RNAi (22). Estas descobertas indicam que embora o RNAi seja potencialmente um mecanismo revolucionário para o tratamento de doenças, é necessária a devida cautela ao interpretar os resultados de nocaute de alvo mediado por RNAi.

O desafio da administração de siRNAs específicos de células ou tecidos é também crucial ao investigar a utilidade das terapias baseadas em RNAi para uma dada doença; várias estratégias para a administração não viral e viral de desencadeadores de RNAi têm demonstrado ser eficazes nos seus respectivos modelos de doença. As vantagens e desvantagens relativas da utilização de siRNAs sintéticos versus shRNAs expressos devem também ser tidas em consideração ao conceber terapias baseadas em RNAi para uma determinada doença.

SiRNAs sintetizados quimicamente são normalmente analisados para a eliminação eficaz de um gene alvo específico. Para aumentar a estabilidade do siRNA, são introduzidas modificações químicas, tais como 2′-O-metilpurinas ou 2′-fluoropyrimidinas (23). Na concepção inicial de uma molécula de siRNA, são rotineiramente utilizados algoritmos computacionais que incorporam vários parâmetros, incluindo estabilidades finais duplex de siRNA para uma selecção adequada de cordão e estruturas secundárias de mRNA para acessibilidade do local alvo. Para melhorar a potência de uma resposta de RNAi, os duplex de siRNA também podem ser concebidos para imitar substratos para processamento de Dicer (24). Os siRNAs mais longos (por exemplo, 27 mers) são incorporados na etapa de carregamento de Dicer da via de RNAi e podem facilitar a activação de RISC. Os 27-mers são concebidos assimetricamente para exibir uma saliência de 2 nt 3′ numa extremidade e uma região romba na outra (25), que orienta o processamento de Dicer e a biogénese da vertente guia adequada, uma vez que o domínio PAZ de Dicer reconhece a extremidade da saliência. Além disso, devido à eficiência de 27 homens no silenciamento de genes mediadores, uma menor concentração de siRNAs pode mediar uma resposta potente de RNAi.

Da perspectiva das aplicações terapêuticas do RNAi, a preocupação mais importante é a entrega dos siRNAs ao tecido apropriado. Numerosas publicações recentes mostraram que os siRNAs podem ser sistematicamente entregues a vários tecidos com a consequente eliminação dos RNAi alvo. A injecção intravenosa de siRNAs para entrega sistémica é realizada através da conjugação de moléculas de siRNA a um grupo de colesterol ou da embalagem de siRNAs em partículas lipossómicas. A entrega sistémica utilizando estas abordagens é eficaz para a entrega ao fígado e jejuno, mas pode não ser apropriada para a entrega a outros órgãos. Num estudo de prova de conceito, os siRNAs visando a apolipoproteína B (APOB) foram utilizados para modificar o metabolismo do colesterol. O grupo 3′ hydroxyl na vertente de passageiros do siRNA foi quimicamente ligado a um grupo de colesterol, e estes siRNAs conjugados derrubaram efectivamente a expressão genética por >50% no fígado e 70% no jejuno (26).

p> Outra abordagem para a entrega sistémica envolve o uso de bilayers lipídicos especializados denominados partículas nucleico-lípidas estáveis (SNALPs), que incorporam siRNAs quimicamente modificados (27). Os lípidos catiónicos e neutros compreendem o bocal, juntamente com um revestimento hidrofílico externo de polietilenoglicol (PEG). Num estudo, foi administrada aos macacos uma dose única de siRNA contendo SNALPs, que baixou os níveis de colesterol durante 11 dias ou mais, com <10% da expressão APOB remanescente no fígado deste modelo de primata não-humano (28). Não foram observadas toxicidades perceptíveis, sugerindo a potencial utilidade deste método na entrega sistémica.

Para a eficácia in vivo das moléculas de siRNA, a dosagem de siRNAs entregues é uma consideração prática, e a entrega selectiva de siRNAs a tecidos específicos reduziria potencialmente a dose efectiva necessária. O alvo dos receptores de superfície celular é uma abordagem vantajosa, uma vez que baixaria a dosagem de siRNA e potencialmente evitaria efeitos fora do alvo da entrega de siRNA a tecidos irrelevantes. O acoplamento de siRNA aos aptamers ou fragmentos de anticorpos, ou a utilização de nanopartículas revestidas com ligandos específicos do receptor, permite a entrega específica de cargas úteis de siRNA a células e tecidos alvo. Para a detecção de células infectadas com VIH, os siRNAs foram acoplados a fragmentos de anticorpos de cadeia pesada (Fabs) que reconhecem a glicoproteína gp120 do envelope do VIH. A protamina com carga positiva foi conjugada a moléculas Fab, e os siRNAs com carga negativa interagiram electrostaticamente com a protamina para formar um complexo Fab-siRNA. Esta abordagem baseada em anticorpos demonstrou >70% de derrubamento da proteína antigénica específica do grupo p24 (Gag) ao visar linfócitos T de cultura infectados com HIV-1 (29). Uma abordagem diferente da focalização tirou partido de um peptídeo do vírus da raiva, que se liga especificamente ao receptor de acetilcolina. Quando este peptídeo foi conjugado a um peptídeo de poliarginina que liga os siRNAs, a entrega de siRNAs ao sistema nervoso central foi realizada, resultando na inibição de uma infecção viral por encefalite fatal (30).

Aptamers, que são ligandos estruturados de RNA, podem ser concebidos para se ligarem especificamente aos receptores de superfície celular e serem ligados covalentemente aos siRNAs para entrega específica in vivo. Um método utilizou aptamers que se ligam ao antigénio de membrana específico da próstata (PSMA) expresso na superfície das células cancerosas da próstata. Quando conjugados com siRNAs, estes aptamer-siRNA híbridos reduziram efectivamente o crescimento tumoral em ratos (31). Uma abordagem semelhante utilizando tanto siRNAs biotinilados como aptamers ligados à estreptavidina proteica de ligação à biotina fez uso de siRNAs de 27 mers para induzir potentemente o silenciamento genético (32).

Coating nanoparticles with cell type-specific ligands is another powerful approach to deliver sistemically RNAi-inducing molecules. Num importante estudo de prova de conceito, os tumores do sarcoma de Ewing foram alvo in vivo com nanopartículas revestidas com ligantes de transferrina (33). Estas nanopartículas foram construídas utilizando policações contendo ciclodextrina (CDPs) especificamente concebidas para incorporar moléculas de siRNA carregadas negativamente. Para maior estabilidade e para evitar agregação, os polímeros de PEG foram ligados à superfície externa utilizando grupos terminais adamantanosos. Os ligandos de transferência foram então covalentemente ligados às cadeias adamantano-PEG, e o desenho de nanopartículas permitiu a auto-montagem em nanopartículas uniformes, ∼50 nanopartículas do tamanho de nanómetro. Os siRNAs incorporados em nanopartículas visavam o produto de fusão genética Ews-Fli1 (Ewing sarcoma breakpoint region 1-flightless 1 homologado) e mostraram inibir a formação de tumor l em ratos (33).

Comentários finais

Em resumo, a progressão desde a descoberta inicial do RNAi até às suas aplicações clínicas tem sido espantosa. A compreensão da biologia fundamental do RNAi levou às suas aplicações generalizadas na investigação básica e, subsequentemente, em aplicações para o tratamento de doenças. Nos próximos anos devemos esperar desvendar mais regulamentação da expressão genética mediada pelo RNAi, e veremos também os medicamentos baseados no RNAi aprovados para uso no tratamento de doenças. Além disso, o RNAi provou ser uma ferramenta poderosa para o estudo da função do gene e abriu novas áreas de investigação básica. Num futuro próximo devemos ver um desenvolvimento contínuo na nossa compreensão e aplicação deste notável mecanismo celular de regulação pós-transcricional da expressão genética.