DNA-typering: Minisatellieten en Short Tandem Repeats
DNA-typering biedt duidelijke voordelen boven de traditionele eiwitanalyse, vooral omdat het informatiever is en kan worden geanalyseerd in minuscuul of gedegradeerd materiaal, aangezien DNA fysisch veel beter bestand is tegen degradatie dan eiwitten. Bovendien kan hetzelfde DNA-genotype worden verkregen uit elk weefsel (d.w.z, bloed, speeksel, sperma, haar, huid en beenderen), terwijl de analyse van eiwitmerkers beperkt blijft tot cellen waarin deze eiwitten tot expressie komen.
Minisatellieten werden aanvankelijk gedetecteerd door hybridisatie van probes op Southern blots van restrictie-enzymatisch verteerde genomische DNA, en gedeelde ‘kernsequenties’ tussen verschillende minisatelliet loci maakten het mogelijk probes toe te passen om vele onafhankelijke minisatellieten tegelijk te detecteren, hetgeen hypervariabele multiband patronen opleverde die bekend staan als DNA fingerprints.
Oorspronkelijk werden multilocus probes voorgesteld voor forensisch genetische analyse. Dit soort probes was echter niet erg succesvol op forensisch gebied, omdat er, hoewel zij zeer informatief zijn, statistische problemen ontstonden bij de evaluatie van het bewijsmateriaal in gevallen van band-matching en standaardisatie. Om deze redenen werden multilocus-probes op forensisch gebied vervangen door het gebruik van specifieke gekloonde minisatellieten, “single locus probes” (SLP’s), die elk slechts één sterk polymorf restrictiefragmentlengtepolymorfisme aan het licht brengen, waardoor de interpretatie eenvoudiger wordt. Doorgaans werden vier SLP’s achtereenvolgens gebruikt om een Southern blot te sonderen, hetgeen acht hypervariabele fragmenten per individu opleverde.
Het was met SLP’s dat het eerste op DNA gebaseerde strafrechtelijk onderzoek werd uitgevoerd; deze zaak culmineerde in de veroordeling van Colin Pitchfork voor een dubbele verkrachting en moord in Leicestershire in 1986. Zeer spoedig werd DNA-analyse de standaardmethode in de forensische genetica, aangezien zij door de meeste laboratoria voor alle toepassingen werd gebruikt, met name bij forensisch onderzoek in strafzaken (vlekkenanalyse en haren) en identificatie.
Tot de invoering van short tandem repeat (STR) analyse door polymerase chain reaction (PCR) amplificatie, was de analyse van minisatellieten met SLP’s zeer populair in forensische laboratoria.
Het belangrijkste voordeel van SLP analyse is de enorme variabiliteit van sommige van de minisatelliet loci en goed gedocumenteerde kennis van het mutatiepercentage in sommige ervan. De belangrijkste nadelen zijn de tijd die nodig is voor de analyse en de behoefte aan relatief grote hoeveelheden niet-afgebroken DNA die nodig zijn voor een succesvolle SLP-typering. Aangezien uit forensische specimens geëxtraheerd DNA vaak door milieuomstandigheden wordt aangetast, hebben SLP-technieken vaak geen betrouwbare resultaten opgeleverd. De PCR heeft deze moeilijkheden overwonnen en heeft het nut van DNA-profileringstechnieken in de forensische wetenschap sterk verbeterd.
De PCR-methode werd in 1987 bedacht en benoemd door Mullis en collega’s bij de Cetus Corporation, hoewel het principe al meer dan tien jaar eerder in detail was beschreven door Khorana et al. Het gebruik van PCR was echter beperkt totdat geschikte hittestabiele DNA-polymerasen van thermofiele bacteriën beschikbaar kwamen.
Met de meeste op PCR gebaseerde DNA-typingsystemen kunnen allelen als discrete entiteiten worden geïdentificeerd, waardoor standaardisatie gemakkelijker wordt doordat de meeste statistische problemen die zich voordoen bij het matchen en binnen van SLP-banden die een continuüm vormen, worden vermeden. Afgezien van de grotere gevoeligheid die inherent is aan elke PCR-techniek, is de kans op succes bovendien groter bij de analyse van oud of sterk gedegradeerd materiaal, voornamelijk vanwege de kleinere omvang van veel DNA-polymorfismen (SNP’s en STR’s), waardoor zij zich beter lenen voor analyse door PCR.
De eerste groep markers die na PCR-amplificatie werd gebruikt, waren de HLA-klasse II genen, met name het HLA DQA1 systeem dat werd geanalyseerd met behulp van sequentiespecifieke oligonucleotide probes. Vrijwel onmiddellijk nadat was aangetoond dat het haalbaar was DNA-merkers te analyseren met behulp van PCR-technologie, kwamen er kits in de handel voor diverse genetische loci. De AmpliType PolyMarker PCR-amplificatiekit (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) was in die tijd zeer populair in forensische laboratoria. Met deze kit worden de loci HLA DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, en GC op een multiplex manier geamplificeerd. De laatste vijf loci werden gelijktijdig getypeerd in één enkele omgekeerde dot-blot strook met ASO-probes; HLA DQA1 werd getypeerd in een afzonderlijke strook.
De inspanningen van forensische wetenschappers werden vervolgens gericht op de amplificatie van fragmentlengtepolymorfismen. De minisatelliet D1S80 (pMCT118) was de eerste die voor forensische analyse werd gebruikt, maar al deze vroege PCR-systemen werden vervangen door STR’s (ook wel microsatellieten genoemd). Analyse van STR’s door PCR is nu de methode bij uitstek voor forensische identificatie op basis van DNA.
STR’s werden in 1989 ontdekt en werden in het begin van de jaren negentig in forensische zaken toegepast. De voordelen van het gebruik van tetra- en pentanucelotide herhalende STR’s (4- en 5-base herhalingseenheden) boven di- en trinucleotiden (2- en 3-base herhalingen) werden al snel duidelijk en een systematische zoektocht naar de meest geschikte STR’s begon. Dit werd gevolgd door het proces van standaardisatie van technieken en nomenclatuur door instanties als SWGDAM in de Verenigde Staten en EDNAP in Europa, plus de actieve rol van de DNA-commissie van de ISFG.
Een andere belangrijke stap was de mogelijkheid om meerdere STR-loci te amplificeren in één gecombineerde multiplex PCR-reactie. Toen deze PCR-benadering werd gekoppeld aan directe detectie van geamplificeerde producten in polyacrylamidegels, werd de profilering van STR-DNA geschikt voor automatisering. Vanaf 1993 waren er commerciële STR-multiplexen voor handmatige elektroforetische systemen beschikbaar. Voor de scheiding van DNA-fragmenten werden denaturerende polyacrylamidegels gebruikt tot de introductie van capillaire elektroforese die, samen met de introductie van fluorescente, met kleurstof gelabelde primertechnologie en het gebruik van DNA-sequencers, een revolutie teweegbracht op dit gebied en de typering van grote STR-multiplexen mogelijk maakte. Sindsdien zijn er verschillende commerciële multiplexen met kleurstof beschikbaar die alle een reeks STR’s plus amelogenine voor geslachtsbepaling omvatten. De momenteel gebruikte multiplexen combineren 15 STRs of meer. Het gecombineerde onderscheidingsvermogen van de STR’s is zeer hoog en de kans dat twee niet-verwante personen toevallig bij elkaar passen (random match probability – RMP) is voor de meeste grotere STR-multiplexen kleiner dan 10-15.
Sinds het midden van de jaren negentig kunnen rechtshandhavingsinstanties dankzij computerdatabases met STR-profielen van monsters van de plaats delict, veroordeelde daders en, in sommige gevallen, personen die zijn gearresteerd maar later van een misdrijf zijn vrijgesproken, daders koppelen aan STR-profielen van de plaats delict. Door toepassing van deze technologie konden wereldwijd duizenden misdrijven worden opgelost.
Ten slotte maakte het nieuwe ontwerp van PCR-primers, die dichter bij de STR-repearegio lagen, het in 2001 mogelijk “mini-STR’s” te maken met mogelijkheden om de analyse van gedegradeerd biologisch materiaal te verbeteren.