RESULTATEN EN DISCUSSIE

Om het myostatinegen van andere diersoorten te klonen, werden cDNA-bibliotheken gemaakt van RNA geïsoleerd uit skeletspierweefsel en gescreend met een muis-myostatinesonde die correspondeert met het geconserveerde C-terminale gebied, dat het rijpe, actieve deel van het molecuul is. Een uitlijning van de voorspelde aminozuursequenties van muis, rat, mens, baviaan, rund, varken, schaap, kip, kalkoen, en zebravis myostatine, afgeleid uit nucleotide sequentie-analyse van full-length cDNA klonen, wordt getoond in Fig. 1. Al deze sequenties bevatten een vermoedelijke signaalsequentie voor secretie en een vermoedelijke RXXR proteolytische verwerkingsplaats (aminozuren 263-266), gevolgd door een regio die de geconserveerde C-terminale cysteïneresiduen bevat die in alle leden van de transformerende groeifactor β familie worden aangetroffen (1). Zoals uit deze uitlijning blijkt, is myostatine in hoge mate geconserveerd over de soorten heen. In feite zijn de sequenties van murine, rat, mens, varken, kip en kalkoen myostatine 100% identiek in het C-terminale gebied na de vermoedelijke proteolytische verwerkingsplaats, en baviaan, rund en schaap myostatine bevatten slechts een tot drie aminozuur verschillen in het volwassen eiwit. Zebravis myostatine is aanzienlijk meer gedivergeerd en is slechts 88% identiek aan de anderen in deze regio.

De hoge mate van sequentiebehoud van myostatine in verschillende soorten suggereert dat de functie van myostatine ook geconserveerd is. Om te bepalen of myostatine een rol speelt bij het reguleren van spiermassa bij andere dieren dan muizen, onderzochten we de mogelijkheid dat mutaties in het myostatinegen een verklaring zouden kunnen zijn voor de toegenomen spiermassa die wordt waargenomen bij dubbel gespierde veerassen. Dubbele bespiering, die de laatste 190 jaar bij veel runderrassen is waargenomen, blijkt als een enkele belangrijke autosomale locus te vererven met verschillende modificatoren van fenotypische expressie, resulterend in onvolledige penetrantie (7). Bij het meest uitvoerig bestudeerde ras van runderen met dubbele bespiering, het Belgisch Witblauw, vererft het fenotype van dubbele bespiering (Fig. 2) als een enkelvoudige genetische locus die musculaire hypertrofie (mh) wordt genoemd (8). De mh-mutatie, die gedeeltelijk recessief is, veroorzaakt een gemiddelde toename van de spiermassa van 20-25%, een afname van de massa van de meeste andere organen (9, 10), en een afname van intramusculair vet en bindweefsel (11). De mh locus is nauw verbonden met markers op een regio van runderchromosoom 2 (12) die syntenisch is met een regio van humaan chromosoom 2 (2q32) (13) waarop we het humane myostatine gen in kaart hadden gebracht door middel van fluorescentie in situ hybridisatie (gegevens niet weergegeven).

De overeenkomsten in fenotype tussen de myostatine-nul muizen en het Belgisch Blauwe runderras en de vergelijkbare kaartposities van het myostatine-gen en de mh-locus suggereerden het runderhomoloog van myostatine als kandidaat-gen voor de mh-locus. Om te bepalen of het myostatinegen van runderen gemuteerd is in het Belgisch Blauwe ras, werden alle drie exonen van het gen van de volbloed Belgisch Blauwe stier, getoond in Fig. 2, geamplificeerd door PCR, gesubkloned en gesequenced. De myostatine-coderende sequentie van de Belgisch-Blauwe stier was identiek aan die van de Holsteinse stier, met uitzondering van een deletie van de nucleotiden 937-947 in het derde exon (Fig. 3). Deze 11-nucleotide deletie veroorzaakt een frame-shift die naar verwachting resulteert in een afgekapt eiwit dat 14 codons stroomafwaarts van de plaats van de mutatie eindigt. Verwacht wordt dat de deletie een null-mutatie is, omdat zij alleen na de eerste 7 aminozuren van de C-terminale regio optreedt, wat resulteert in een verlies van 102 aminozuren (aminozuren 274-375). Deze mutatie is vergelijkbaar met de gerichte mutatie in myostatine-nul muizen, waarbij de gehele regio die codeert voor het rijpe eiwit werd verwijderd (2). Door middel van Southern blot analyse, waarbij oligonucleotiden werden gebruikt die correspondeerden met het wild-type of de mutantsequentie, werd deze mutatie in beide allelen aangetroffen in 14/14 onderzochte volbloed Belgische Blauwe runderen (gegevens niet weergegeven).

Wij hebben ook de sequentie van het myostatinegen in een ander runderras, de Piemontees, bepaald, waarin dubbele bespiering met een extreem hoge frequentie voorkomt (4). De Piemontese sequentie bevatte 2 nucleotide veranderingen ten opzichte van de Holsteinse sequentie. De ene was een C naar A transversie in exon 1, resulterend in een conservatieve vervanging van leucine door fenylalanine (aminozuur 94). De tweede was een G naar A overgang in exon 3, resulterend in een cysteïne naar tyrosine substitutie in de rijpe regio van het eiwit (aminozuur 313) (Fig. 3). Door middel van Southern blot analyse werd deze mutatie in beide allelen aangetroffen in 10/10 onderzochte dubbelgespierde Piemontese runderen. Deze mutatie leidt waarschijnlijk tot een volledig of bijna volledig verlies van functie, aangezien dit cysteïnerester niet alleen bij alle myostatine-sequenties onveranderlijk is, maar ook bij alle bekende leden van de transformerende groeifactor β-superfamilie (1). Dit cysteïneresidu is bekend als een van de aminozuren die betrokken zijn bij de vorming van de intramoleculaire cystineknoopstructuur in leden van deze superfamilie waarvan de driedimensionale structuur bekend is (14-17). Bovendien, wanneer het corresponderende cysteïne in activine A (cysteïne-44) gemuteerd werd in alanine, had het mutante eiwit slechts 2% van de wild-type receptorbinding en biologische activiteit (18).

De vergelijkbare kaartposities van het myostatinegen en de mh locus en de identificatie van relatief ernstige mutaties in het myostatinegen van twee verschillende dubbel gespierde runderrassen suggereren dat deze mutaties verantwoordelijk zijn voor het dubbele bespieringsfenotype. Om deze hypothese verder te ondersteunen, hebben wij DNA geanalyseerd van 120 individuele volbloed of raszuivere runderen van 16 andere rassen die niet als dubbel bespierd zijn geclassificeerd (11 Angus, 11 Charolais, 10 Holstein, 10 Brown Swiss, 10 Polled Hereford, 10 Gelbvieh, 9 Simmental, 9 Jersey, 9 Guernsey, 9 Ayrshire, 7 Limousin, 4 Brahman, 4 Polled Shorthorn, 4 Red Angus, 2 Chianina, en 1 Texas Longhorn) voor de aanwezigheid van elk van deze mutaties (Fig. 4). Met behulp van Southern blot analyse werd de cysteïne-tyrosine-substitutie die bij het Piëmontese ras voorkomt bij geen van de 120 individuen aangetoond. De 11-nucleotide deletie die aanwezig is in het Belgisch Blauwe ras werd gedetecteerd in één allel van één enkele Red Angus niet-dubbelgespierde volbloedstier. In dit verband is gesuggereerd dat het fenotype van dubbele bespiering, dat af en toe bij veel rassen voorkomt, te wijten kan zijn aan een enkele mutatie of zeer weinig mutaties die tijdens de ontwikkeling van de moderne runderrassen in veel Europese runderrassen zijn terechtgekomen (7). Onze resultaten tonen aan dat myostatinemutaties die dubbele bespiering veroorzaken ten minste tweemaal bij runderen zijn voorgekomen.

Ten slotte hebben wij, om de aanwezigheid van andere myostatinemutaties bij niet-dubbelgespierde rassen uit te sluiten, de volledige sequentie bepaald van de myostatine-coderende regio van 11 van deze rassen (Angus, Charolais, Brown Swiss, Polled Hereford, Gelbvieh, Guernsey, Ayrshire, Limousin, Brahman, Polled Shorthorn, en Texas Longhorn). Deze analyse bracht alleen polymorfismen aan het licht die ofwel stille veranderingen in de coderende sequenties waren, ofwel aanwezig waren in de introns en niet-vertaalde regio’s.

In tegenstelling tot bij muizen veroorzaakt een myostatine-nulmutatie bij runderen een verkleining van de omvang van interne organen en slechts een bescheiden toename van de spiermassa (20-25% bij het Belgisch Blauwe ras, vergeleken met 200-300% bij myostatine-deficiënte muizen). Het is mogelijk dat runderen, na generaties van selectief fokken op grote spiermassa, dichter bij een maximale limiet van spiermassa zitten, in tegenstelling tot muizen, die niet op soortgelijke wijze zijn geselecteerd. In dit verband bevat de myostatine-sequentie, zelfs bij runderrassen die niet zwaar gespierd zijn, twee aangrenzende niet-conservatieve aminozuurverschillen (EG vs. KE) in de C-terminale regio, vergeleken met alle andere onderzochte diersoorten. Hoewel de functionele betekenis van deze verschillen onbekend is, is het mogelijk dat deze twee veranderingen een gedeeltelijk verlies-van-functie allel vertegenwoordigen dat in de loop van vele jaren fokken in de populatie is gefixeerd.

Voor landbouwkundige toepassingen zijn er enkele nadelen aan dubbelgespierd vee, namelijk de verminderde vrouwelijke vruchtbaarheid, lagere levensvatbaarheid van de nakomelingen, en vertraging in de seksuele rijping (19). Bij het Belgisch Witblauw ras worden deze nadelen echter ruimschoots gecompenseerd door de toegenomen spiermassa en de verhoogde voerefficiëntie (20). Het feit dat een null-mutatie in het myostatinegen bij runderen resulteert in dieren die nog steeds levensvatbaar en vruchtbaar zijn en vlees van hoge kwaliteit produceren, toont de potentiële waarde aan van het produceren van een toename van de spiermassa bij andere vleesdieren zoals schapen, varkens, kippen, kalkoenen en vissen door de myostatinefunctie te verstoren. De hoge graad van behoud van sequenties in dieren variërend van zoogdieren tot vogels en vissen suggereert dat de biologische functie van myostatine in het hele dierenrijk bewaard is gebleven.