Cellulair DNA wordt voortdurend geoxideerd door verschillende endogene en exogene agentia, en de resulterende DNA-schade kan het risico op het ontwikkelen van kanker en andere ziekten verhogen . Guanine heeft het laagste redoxpotentiaal van de vier DNA basen en wordt daarom het gemakkelijkst geoxideerd.

Tijdens DNA replicatie induceert adenine incorporatie tegenover een guanine oxidatieproduct een G:C-T:A transversie, terwijl guanine incorporatie tegenover een guanine oxidatieproduct een G:C-C:G transversie veroorzaakt. Deze mutaties (zie referenties in ) worden in veel belangrijke genen aangetroffen, en in het bijzonder op CpG-locaties in het p53 tumorsuppressorgen en in codons 12 en 13 van het K-ras oncogen. Daarom is het belangrijk om de nucleotide incorporatie en DNA extensie voor elk guanine oxidatie product te analyseren om de mechanismen die ten grondslag liggen aan het genereren van G:C-T:A en G:C-C:G transversies op te helderen.

8-Oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) (Fig. 1) is één van de meest voorkomende oxidatieve DNA laesies en wordt gevormd onder verschillende oxidatieve omstandigheden. 8-OxoG is uitvoerig bestudeerd, heeft een significante biologische impact en is een alomtegenwoordige marker van oxidatief beschadigd DNA. Structurele analyses hebben aangetoond dat 8-oxoG een anti of syn conformatie aanneemt: 8-oxoG in de anti conformatie vormt Watson-Crick basenparen met cytosine, terwijl de laesie in de syn conformatie de Hoogsteen rand van de laesie gebruikt om een basenpaar met adenine te vormen (Fig. 2). Bovendien nemen DNA-polymerasen naast cytosine ook adenine op tegenover 8-oxoG , en induceert 8-oxoG een G:C-T:A-transversie in Escherichia coli (E. coli) en zoogdiercellen.

Hoewel 8-oxoG G:C-T:A transversies veroorzaakt, kan het mechanisme dat ten grondslag ligt aan het ontstaan van G:C-C:G transversies niet worden verklaard door 8-oxoG. Bovendien wordt 8-oxoG gemakkelijker geoxideerd dan guanine vanwege zijn lagere oxidatiepotentiaal, en dus worden verschillende oxidatieve laesies geproduceerd door de oxidatie van 8-oxoG. Daarom is het noodzakelijk om zowel 8-oxoG als andere geoxideerde guanine laesies te bestuderen om de verschillende fenomenen veroorzaakt door guanine oxidatie te begrijpen.

Guanine oxidatieproducten die G:C-C:G transversies veroorzaken vormen basenparen door waterstofbinding met guanine

Zoals eerder vermeld, wordt G:C-C:G transversie veroorzaakt door incorporatie van guanine tegenover een guanine oxidatieproduct. In deze paragraaf beschrijven we eerst de “A-regel”. Adenine is de meest voorkomende base die door DNA-polymerasen tegenover een abasische plaats wordt ingebouwd, wat suggereert dat, van de vier natuurlijke basen, adenine de meeste hydrofobe interacties vormt en de beste ruimtelijke compatibiliteit vertoont met een abasische plaats. Adenine incorporatie vereist niet noodzakelijk de vorming van waterstofbruggen met verschillende beschadigde DNA plaatsen in template DNA. Daarentegen vereist de preferentiële incorporatie van guanine de vorming van waterstofbruggen, naast hydrofobe interacties en ruimtelijke compatibiliteit, met de templating base. Om de laesies te ontdekken die G:C-C:G-transversies veroorzaken, is het dus belangrijk om guanine-oxidatieproducten te onderzoeken die door waterstofbruggen met guanine basenparen vormen.

Mogelijke guanine-oxidatieproducten die G:C-C:G-transversies veroorzaken

Iz wordt langzaam gehydrolyseerd tot 2,2,4-triamino-5(2H)-oxazolone (Oz) (Fig. 1) in neutrale waterige oplossing, en zijn halfwaardetijd is 147 min onder fysiologische omstandigheden. Bovendien worden 2-6 moleculen van Oz gedetecteerd per 107 guanine basen in lever-DNA , en onlangs werd aangetoond dat de hoeveelheid Oz aanzienlijk wordt verhoogd in de aanwezigheid van 5-methylcytosine . De biologische invloed van Oz in DNA replicatie is dus waarschijnlijk groter dan die van Iz.

Klenow fragment exo integreert adenine tegenover Oz in vitro , en Oz veroorzaakt G:C-T:A transversies in E. coli . In ons in vitro reactiesysteem daarentegen, integreert het Klenow fragment exo- ofwel adenine ofwel guanine tegenover Oz . Bovendien toonden wij aan dat DNA polymerasen α, β, δ, en ε elk alleen guanine tegenover Oz opnemen; DNA polymerasen γ, κ, en Sulfolobus solfataricus DNA polymerase IV, naast het Klenow fragment exo-, nemen elk guanine en adenine op; DNA polymerase η neemt guanine, adenine en cytosine op; DNA polymerasen ζ en ι nemen elk guanine, adenine, cytosine en thymine op; en REV1 neemt cytosine op. Deze analyses geven aan dat DNA-polymerasen, met uitzondering van REV1, guanine tegenover Oz inbouwen. We voorspelden dat Oz een stabiel basenpaar kan vormen met guanine, en dat dit Oz:G basenpaar twee waterstofbruggen heeft en planair is (Fig. 3c) . We hebben onlangs thermische denaturatie experimenten uitgevoerd en gerapporteerd dat het Oz:G basenpaar thermodynamischer stabiel is dan Oz:A, Oz:C, en Oz:T .

Daarnaast verlengen de DNA polymerasen α, β, γ, δ, ε, η, κ, en ζ elk de primer tot de volledige lengte over Oz heen. Oz lijkt dus een geoxideerde laesie te zijn die verband houdt met de inductie van G:C-C:G-transversies. Met name DNA polymerase ζ verlengt voorbij Oz met bijna dezelfde efficiëntie als voorbij G , maar niet voorbij tetrahydrofuran (THF; een chemisch stabiele abasische site analoog), 8-oxoG, of O 6-methylguanine . Deze gegevens geven aan dat DNA polymerase ζ is een effectieve fout-gevoelige replicatie polymerase voor Oz. Bovendien, alleen REV1 integreert cytosine tegenover Oz, en de frequentie van cytosine insertie volgt de volgorde Oz > guanidinohydantoïne (Gh) > THF > 8-oxoG . Gezien het feit dat REV1 kan interageren met DNA polymerases , de collectieve resultaten tot nu toe suggereren dat REV1 samen met DNA polymerase ζ zou kunnen voorkomen dat G:C-C:G transversies . Dergelijke systemen voor het voorkomen van mutatie worden gezien in andere DNA-polymerasen .

Reactie van oligonucleotiden die oz met reparatie-enzymen

Cellen maken gebruik van een aantal mechanismen om mutagene effecten van de hierboven beschreven vormen van DNA-schade te voorkomen, en hebben verschillende enzymen die DNA-schade zoals 8-oxoG herstellen .

E. coli formamidopyrimidine DNA-glycosylase en endonucleasen III enzymen excideren Oz uit dubbelstrengs DNA-oligomeren . Bovendien verwijderen het menselijke NTH1 en NEIL1, die homologen zijn van E. coli endonucleasen III en VIII, Oz even efficiënt als zij 5-hydroxyuracil verwijderen, en hun reactiviteit ten opzichte van Oz is hoger dan ten opzichte van 8-oxoG . Aangezien Oz gevoeliger is dan 8-oxoG voor behandeling met piperidine, hangt dit verschil in reactiviteit af van de sterkte van de N-glycoside binding.

We hebben de incisie-activiteiten van andere reparatie-enzymen op Oz geanalyseerd. Chlorella-virus pyrimidine dimeer glycosylase, dat incisie-activiteit vertoont ten opzichte van cyclobutaan pyrimidine dimeer, reageert met Oz-bevattend dubbelstrengs DNA. Zijn reactiviteit ten opzichte van Oz is hoger dan ten opzichte van 8-oxoG, wat erop wijst dat de reactiviteit afhankelijk is van de N-glycosidische bindingssterkte, vergelijkbaar met die van menselijk NEIL1 en NTH1 . Dit reparatie-enzym vertoont echter een matige activiteit ten opzichte van Oz vergeleken met zijn activiteit ten opzichte van cyclobutaan pyrimidine dimeer.

Endonuclease IV, een apurinisch/apyrimidinisch endonuclease, sneed Oz met een waargenomen activiteit die een derde tot een vierde is van die ten opzichte van THF , maar met een grotere efficiëntie dan zijn activiteit ten opzichte van Gh. Deze resultaten suggereren dat Oz structureel meer lijkt op een abasische plaats dan Gh.

Endonuclease V, die activiteit vertoont ten opzichte van hypoxanthine residuen, is ook actief ten opzichte van Oz. Deze activiteit is bij hoge concentraties van endonuclease V lager dan die voor hypoxanthine, maar endonuclease V herkent Oz veel efficiënter dan Gh. Endonuclease V kan wel uracil maar geen thymine herkennen, wat suggereert dat de 5′-methylgroep kritisch is voor herkenning door endonuclease V . Zoals eerder beschreven, heeft Gh, in tegenstelling tot de gesloten ringstructuur van Oz (Fig. 1), een deel dat uit de ring steekt, vergelijkbaar met thymine. Endonuclease V herkent Oz dus wel, maar Gh niet.

Human OGG1 en AP endonuclease 1 kunnen geen Oz-residuen excideren, en single-strand-selective monofunctional uracil-DNA glycosylase 1 vertoont geen incisie-activiteit ten opzichte van Oz (gegevens niet weergegeven). E. coli Mut Y kan niet reageren op Oz:G- en Oz:A-laesies (gegevens niet aangetoond). Oz is een zwak substraat voor humaan nucleotide-excisieherstel omdat de beschadigde plaats minder volumineus is dan die van pyrimidine (6-4) pyrimidon fotoproducten, waardoor het voor XPC-RAD23B moeilijk is Oz te herkennen.

De tot nu toe beschikbare gegevens geven aan dat humaan NEIL1 en NTH1 de meest waarschijnlijke reparatie-enzymen voor Oz zijn. Menselijk NEIL1, NTH1, E. coli endonucleasen III, en formamidopyrimidine DNA-glycosylase kunnen echter allemaal Oz uit dubbelstrengs DNA verwijderen, ongeacht het type base tegenover Oz . Als de base tegenover Oz adenine, guanine of thymine is vóór basisexcisie-reparatie, wordt de genetische informatie bij volgende replicaties gewijzigd. Het is dus mogelijk dat er onbekende enzymen zijn die Oz nauwkeurig kunnen verwijderen uit oligonucleotiden waarin Oz aan een C is gekoppeld, net zoals het menselijke OGG1 8-oxoG kan verwijderen. Een andere mogelijkheid is, zoals eerder vermeld, dat REV1-DNA polymerase ζ G:C-C:G transversies kan voorkomen.

Belemmert OzOz de DNA synthese door DNA polymerases?

Contiguë guanines (GG), die voorkomen in veel belangrijke genomische regio’s zoals het K-ras oncogen , worden gemakkelijker geoxideerd dan een enkele guanine vanwege hun lagere redox potentiaal. De oxidatie van GG sequenties onder hoge oxidatie omstandigheden resulteert in een aaneengesloten geoxideerde guanine laesie. We hebben eerder gerapporteerd dat IzIz wordt geproduceerd door de oxidatie van GG in enkel- en dubbelstrengs DNA , wat suggereert dat hydrolyse van deze Iz moleculen twee aaneengesloten Oz moleculen produceert (OzOz). Verwacht wordt dat OzOz de DNA synthese effectiever stagneert dan een enkele Oz en dus een ernstiger DNA schade vertegenwoordigt dan een enkele Oz.

Onze analyse toonde aan dat DNA polymerase κ geen enkele nucleotide tegenover OzOz integreerde . Klenow fragment exo nam bij voorkeur een adenine op tegenover de 3′ Oz van OzOz laesies, REV1 nam cytosine op, en DNA polymerase β nam guanine op. DNA polymerase α opgenomen guanine, adenine en cytosine tegenover de 3 ‘Oz van OzOz laesies, en guanine werd opgenomen gemakkelijker dan adenine en cytosine . DNA polymerase ι lichtjes opgenomen guanine, adenine en thymine . Of een base nu is opgenomen of niet, deze polymerasen kunnen de primer niet verlengen tot de volledige lengte over OzOz .

In tegenstelling hiermee verlengde DNA polymerase η de primer tot de volledige lengte over OzOz laesies met een bescheiden efficiëntie in vergelijking met over cyclobutaan pyrimidine dimeer laesies, waarbij de synthese van de meeste DNA stagneert bij de 3′ of 5′ Oz van OzOz . In tegenstelling, DNA polymerase ζ kon efficiënt strekken de primer tot full-length over OzOz , wat suggereert dat DNA polymerase ζ is een belangrijk enzym voor translesion synthese langs zowel enkele en aaneengesloten Oz moleculen. Bovendien, DNA polymerase ζ neemt alle nucleotiden tegenover zowel de 3′ en 5′ Oz en is een foutgevoelig DNA polymerase voor OzOz.

Photooxidation in quadruplex DNA

Guanine-rijke sequenties zoals telomeren kunnen vouwen in quadruplex structuren . In dubbelstrengs DNA is de één-elektron oxidatie van guanine in aaneengesloten guanine-sequenties afhankelijk van de lokalisatie van de hoogst bezette moleculaire orbitaal (HOMO) . In tegenstelling tot dubbelstrengs DNA, wordt de 3′-guanine van d(TGGGGT) voornamelijk geoxideerd in quadruplex DNA, en de geschatte HOMO is gelokaliseerd op de 3′-guanine (Fig. 4b). Gezien onze huidige kennis van dubbelstrengs DNA en quadruplex DNA, vindt de selectieve één-elektron oxidatie van guanine plaats op de gelokaliseerde HOMO, ongeacht de DNA structuur.

Aan de andere kant zijn de guanine-oxidatieproducten afhankelijk van de DNA-structuur. Zo is Iz een belangrijk product in enkelstrengs DNA, terwijl 8-oxoG en dehydroguanidinohydantoïne (Ghox) vooral in quadruplex DNA worden gevormd. Iz, 8-oxoG, Ghox en Gh worden gevormd in dubbelstrengs DNA, en zijn ook belangrijke oxidatieproducten die worden aangetroffen in enkelstrengs en quadruplex DNA .

Het mechanisme van guanine oxidatie in enkelstrengs, dubbelstrengs, en quadruplex DNA kan als volgt worden verklaard. Eén-elektron oxidatie van guanine genereert een guanine radicaal kation (G-+) , gevolgd door twee afbraakroutes (Fig. 5). In de ene route wordt G-+ gedeprotoneerd op de N1 positie, gevolgd door generatie van Iz. In een andere route wordt G-+ gehydrateerd en gedeprotoneerd, gevolgd door de generatie van 8-oxoG, Ghox, en Gh. Er is een waterstofbrug tussen het N1 proton van G-+ en de O6 van guanine in quadruplex DNA (Fig. 6a), en er wordt een waterstofbrug gevormd tussen het N1 proton van G-+ en de N3 van cytosine in dubbelstrengs DNA (Fig. 6b). Daarom wordt de deprotonatie van G-+ aanzienlijk geremd in quadruplex DNA en gedeeltelijk geremd in dubbelstrengs DNA. We schatten dat het gemak van deprotonatie de volgorde volgt: enkelstrengs DNA > dubbelstrengs DNA > quadruplex DNA , en deze volgorde verklaart de verschillen in oxidatieproducten in elk type DNA-structuur.