In de jaren 1930 werd nog gezocht naar een manier om zowel direct als verstrooid licht van alle azimutten te gebruiken om goede contrastbeelden te verkrijgen van onbevlekte voorwerpen die geen licht absorberen. Onderzoek door Frits Zernike in deze periode bracht fase- en amplitudeverschillen aan het licht tussen licht van de nul-orde en afwijkend licht, die kunnen worden veranderd om gunstige voorwaarden te scheppen voor interferentie en contrastverbetering.

Geïsoleerde preparaten die geen licht absorberen worden fase-objecten genoemd omdat zij de fase van het door het preparaat verstrooide licht enigszins veranderen, gewoonlijk door dergelijk licht ongeveer 1/4 golflengte te vertragen ten opzichte van het niet-afwijkende directe licht dat onaangetast door of rond het preparaat valt. Helaas zijn onze ogen, evenals de camerafilm, niet in staat deze faseverschillen waar te nemen. Nogmaals, het menselijk oog is alleen gevoelig voor de kleuren van het zichtbare spectrum (variaties in lichtfrequentie) of voor verschillende niveaus van lichtintensiteit (variaties in golfamplitude).

In fase-exemplaren gaat het directe licht van de nul-orde onveranderd door of om het proefstuk heen. Het licht dat door het specimen wordt gebroken, wordt echter niet in amplitude verminderd zoals in een lichtabsorberend voorwerp, maar wordt door het specimen vertraagd vanwege de brekingsindex of de dikte (of beide) van het specimen. Dit verstrooide licht, met een achterstand van ongeveer 1/4 golflengte, komt in het beeldvlak aan uit de pas (ook wel uit fase genoemd) met het niet-verstrooide licht, maar, door interferentie, in wezen niet in intensiteit verminderd. Het resultaat is dat het beeld ter hoogte van het oculair zo weinig contrast heeft dat de details bijna onzichtbaar worden.

Zernike slaagde erin een methode te bedenken – die nu bekend staat als fasecontrastmicroscopie – om niet-gekleurde, fase-objecten contrastbeelden te laten opleveren alsof het amplitude-objecten zijn. Amplitude-objecten vertonen een uitstekend contrast wanneer het verstrooide en het directe licht een 1/2 golflengte uit de pas lopen (een faseverschil vertonen). De methode van Zernike bestond erin het directe licht met 1/4 golflengte te versnellen, zodat het verschil in golflengte tussen het directe en het verstrooide licht voor een faseobject nu 1/2 golflengte zou bedragen. Hierdoor zouden het directe en het afwijkende licht die op het beeldniveau van het oculair aankomen, destructieve interferentie kunnen veroorzaken (zie het eerder beschreven gedeelte over beeldvorming voor absorberende voorwerpen). Een dergelijke procedure leidt ertoe dat de details van het beeld donkerder lijken tegen een lichtere achtergrond. Dit wordt donker of positief fasecontrast genoemd. Een schematische afbeelding van de basisconfiguratie van de fasecontrastmicroscoop is weergegeven in figuur 1.

Een andere mogelijkheid, die veel minder vaak wordt toegepast, is het directe licht met 1/4 golflengte te vertragen, zodat het verstrooide licht en het directe licht in stap bij het oculair aankomen en constructief kunnen interfereren. Deze opstelling resulteert in een helder beeld van de details van het preparaat op een donkerder achtergrond, en wordt negatief of helder contrast genoemd.

Fasecontrastmicroscopie was zeer succesvol en werd uiteindelijk op grote schaal toegepast, hetgeen resulteerde in de toekenning door Zernike van de prestigieuze Nobelprijs voor de natuurkunde in 1953. De fasecontrasttechniek werd geprezen als de grootste vooruitgang in de microscopie in een eeuw. Fasecontrast, door fase-exemplaren zoals levend materiaal “om te zetten” in amplitude-exemplaren, stelde wetenschappers in staat details in ongekleurde en/of levende objecten te zien met een helderheid en resolutie die nooit eerder waren bereikt.

De Zernike-methode omvat de scheiding van het directe licht van de nul-orde van het verstrooide licht in het achterste brandvlak van het objectief. Hiertoe wordt een ringvormige ring direct onder de onderste lens van de condensor geplaatst in het voorste brandpuntsvlak van de condensor, dat geconjugeerd is met het achterste brandpuntsvlak van het objectief. Terwijl de holle lichtkegel van de annulus onvertekend door het preparaat gaat, komt hij in de vorm van een lichtring aan in het achterste brandvlak van het objectief. Het zwakkere licht dat door het preparaat wordt gebroken, wordt over het gehele achterste brandvlak van het objectief verspreid.

Als deze combinatie, zoals nu, naar het beeldvlak van het oculair zou worden doorgelaten, zou het gebroken licht ongeveer 1/4 golflengte achter het directe licht liggen. In het beeldvlak zou de fase van het gebroken licht uit fase zijn met die van het directe licht, maar de amplitude van hun interferentie zou bijna gelijk zijn aan die van het directe licht. Dit zou resulteren in een zeer gering preparaatcontrast.

Om het directe ongedifferentieerde licht van de nul-orde te versnellen, wordt in het achterste brandvlak van het objectief een faseplaat aangebracht met een ringvormige faseverschuiver eraan vastgemaakt. Het smalle gedeelte van de faseplaat is optisch dunner dan de rest van de plaat. Daardoor legt het ongedifferentieerde licht dat door de faseringsring gaat een kortere weg af door het glas van het objectief dan het verstrooide licht.

Nu, wanneer het directe ongedifferentieerde licht en het verstrooide licht zich naar het beeldvlak begeven, zijn zij een halve golflengte uit fase met elkaar. Het gebroken en het directe licht kunnen nu destructief interfereren, zodat de details van het preparaat donker lijken tegen een lichtere achtergrond (net zoals bij een absorberend of amplitief preparaat). Dit is een beschrijving van wat er gebeurt bij positief of donker fasecontrast.

Als het ringfasewisselgebied van de faseplaat dikker zou worden gemaakt dan de rest van de plaat, wordt het directe licht met 1/4 golflengte vertraagd. In dit geval komt het licht van de nul-orde in het beeldvlak aan in stap (of in fase) met het verstrooide licht, en vindt constructieve interferentie plaats. Het beeld zou helder lijken op een donkere achtergrond. Het beeld verschijnt helder op een donkere achtergrond. Dit type fasecontrast wordt omschreven als negatief of helder contrast.

Omdat het niet-afwijkende licht van de nul-orde veel helderder is dan het zwakke diffracterende licht, wordt een dunne absorberende transparante metaallaag op de ring afgezet om het directe en het diffracterende licht in een beter evenwicht van intensiteit te brengen en zo het contrast te vergroten. Omdat het versnellen of vertragen van het directe licht berekend wordt op 1/4 golflengte groen licht, zal het fasebeeld het best verschijnen wanneer een groen filter in de lichtweg wordt geplaatst (een groen interferentiefilter verdient de voorkeur). Een dergelijk groen filter helpt ook achromatische objectieven om hun beste beelden te produceren, omdat achromaten sferisch gecorrigeerd zijn voor groen licht.

De accessoires die nodig zijn voor fasecontrast werk zijn een subfase fasecontrast condensor uitgerust met annuli en een set fasecontrast objectieven, waarbij in elk objectief een faseplaat is gemonteerd. De condensor heeft gewoonlijk een helderveldstand met een diafragma en een draaibare revolver van annuli (elk fase-objectief van verschillende vergroting heeft een annulus nodig van toenemende diameter naarmate de vergroting van het objectief toeneemt). Elk fase-objectief heeft een verduisterde ring op het achterste objectief. Dergelijke objectieven kunnen ook worden gebruikt voor gewoon helderveld doorvallend licht werk met slechts een geringe vermindering van de beeldkwaliteit.

De fase-uitrusting, zoals geleverd door de fabrikant, bevat meestal een groen filter en een fase telescoop. Deze laatste wordt gebruikt om de microscopist in staat te stellen de annulus van de condensor te richten en op de ring van de faseplaat te plaatsen. Een set van centreerschroeven in de substage condensor maakt manipulatie van de annulus om het uit te lijnen terwijl het observeren van de achterste brandvlak van het objectief met de fase telescoop (of door een Bertrand lens).

Om een fase microscoop op te zetten (wang voering cellen zijn een gemakkelijk verkrijgbare testmateriaal), focus het specimen met de 10X fase objectief. Configureer vervolgens de microscoop voor Köhler verlichting met behulp van de helderveld (0) positie van de condensor. Deze cruciale stap moet ervoor zorgen dat het objectief, de condensor en het velddiafragma van de microscoop correct zijn uitgelijnd. Nadat de microscoop juist is uitgelijnd, opent u het diafragma van de condensor en draait u de revolver van de condensor in de 10-stand (dit opent gewoonlijk automatisch het diafragma). Plaats het groene filter in de lichtweg en verwijder een van de oculairen. Plaats de fasetelescoop en centreer, terwijl u de achterkant van het objectief in de gaten houdt, de annulus met behulp van de annulus centreerschroeven naar de ring van de plaat. Met een Bertrand-lens of een pinhole-oculair, indien beschikbaar, kan het achterste brandvlak van het objectief worden bekeken. Het centreren van de fase annulus is vaak gemakkelijker uit te voeren als het preparaat tijdelijk uit het lichtpad wordt verwijderd. Na het uitlijnen van de fase ring met de annulus, plaats het oculair terug en plaats het preparaat terug op de juiste plaats op de microscooptafel in het optische pad.

Herhaal dezelfde procedure voor elk objectief, ervoor zorgend dat de revolver is gedraaid zodat de juiste fase annulus is gepositioneerd om overeen te komen met de objectief vergroting. Sommige fabrikanten leveren individuele indrukbare, centreerbare annuli die in het onderste deel van de gewone Abbe condensor kunnen worden geplaatst. Dergelijke goedkope, eenvoudige apparaten doen het goed met de 10X, 20X, en 40X fase-objectieven, maar de condensor kan er slechts één tegelijk ontvangen.

Fase-microscopie blijft een veel gebruikt en belangrijk instrument, vooral voor de microscopist die levend en/of ongekleurd materiaal bestudeert, zoals cellen en weefsels in cultuur. De methode wordt momenteel ook gelijktijdig gebruikt met fluorescentie met gereflecteerd licht om gebieden van een preparaat zichtbaar te maken die niet fluoresceren. Fasemicroscopietechnieken zijn vooral nuttig bij preparaten die dun en verspreid in het gezichtsveld liggen.

Er zijn enkele beperkingen van fasecontrastmicroscopie:

• Fasebeelden worden gewoonlijk omgeven door halo’s rond de contouren van details. Dergelijke halo’s zijn optische artefacten, die soms de grenzen van details versluieren.
• De fase-annuli beperken de numerieke apertuur van het optische systeem tot op zekere hoogte, waardoor de resolutie afneemt.
• Fasecontrast werkt niet goed met dikke preparaten, omdat er faseverschuivingen optreden van gebieden iets onder of iets boven het vlak dat in focus is. Dergelijke faseverschuivingen verwarren het beeld en vervormen de beelddetails.
• Fasebeelden zien er grijs uit als wit licht wordt gebruikt en groen als een groen filter wordt gebruikt. In het verleden beperkten veel microscopisten hun film tot zwart-wit bij het uitvoeren van fotomicrografie op fasemonsters. Tegenwoordig reproduceren veel kleurenfilms zeer effectief zwart, wit en grijstinten, vooral de wolfraam-gebalanceerde transparantiefilms van Fuji, Kodak, en Agfa.

hasemicroscopie is een ander voorbeeld van hoe de manipulatie van licht op het niveau van de onderlens van de subcondensor en op het niveau van het achterste brandvlak van het objectief een aanzienlijk effect heeft op het beeld dat door het oculair wordt waargenomen.