Na 15 jaar in het New England Hospital te hebben gewerkt, werd Mahoney in 1878 op 33-jarige leeftijd toegelaten tot hun verpleegstersopleiding. Het 16 maanden durende programma was zeer rigoureus en bestond uit 16-urige werkdagen. Wanneer de studenten niet op de afdelingen van het ziekenhuis werkten of privé-diensten bij patiënten thuis deden, werden zij geacht de hele dag lessen en lezingen bij te wonen. Slechts vier van de oorspronkelijke 42 studenten die aan het programma begonnen, hadden het uithoudingsvermogen en de wilskracht om de cursus te voltooien. Toen zij in 1879 haar diploma ontving, werd zij de eerste zwarte Amerikaanse beroepsverpleegster en voegde zich in de rij van beroemde verpleegsters in de geschiedenis.

Mahoney wijdde zich gedurende het grootste deel van haar 30-jarige carrière aan de verpleging in privédienst vanwege de nog steeds heersende raciale vooroordelen in de openbare verpleging. Veel van haar patiënten kwamen uit prestigieuze families en waren onder de indruk van haar bekwaamheid en professionaliteit. Aan het eind van haar loopbaan was zij directrice van een zwart weeshuis in New York. Ze wijdde zich aan haar werk en trouwde nooit.

In 1896 sloot Mahoney zich aan bij de pas opgerichte en voornamelijk blanke Nurses Associated Alumnae of the United States and Canada, later bekend als de American Nurses Association (ANA). Omdat deze vereniging zo traag was met het toelaten van zwarte leden, hielp ze de National Association of Colored Graduate Nurses (NACGN) op te richten en sprak ze op hun eerste conventie in 1909. Ze sprak toen over de ongelijkheid voor Afro-Amerikanen in de verpleegkundige opleiding en vroeg om een demonstratie in het New England Hospital. De conventie steunde haar van ganser harte, koos haar tot aalmoezenier en gaf haar een levenslang lidmaatschap. Jarenlang werkte zij aan het werven van verpleegsters uit minderheidsgroepen voor de organisatie. Grotendeels door haar inspanningen verdubbelde het aantal Afro-Amerikaanse verpleegsters van 1910 tot 1930.