De late profase, of prometafase, begint met de verbreking van het kernomhulsel, dat uiteenvalt in kleine membraandeeltjes die sterk lijken op het endoplasmatisch reticulum en meestal zichtbaar blijven rond de mitotische spindel. Tijdens deze periode blijven de chromosomen condenseren en worden zij geleidelijk korter en dikker totdat zij volledig de eenheden hebben gevormd die de mitose zullen ondergaan. Ook de nucleolus, die in sommige cellen nog aanwezig kan zijn, verdwijnt volledig in de prometafase.

Op de bovenstaande digitale fluorescentiemicroscopie-afbeelding is een enkele niercel van de ratkangoeroe (PtK2) te zien in de vroege stadia van de prometafase. Het chromatine is gekleurd met een blauwe fluorescente probe (DAPI), terwijl het microtubuli netwerk (mitotische spindel) groen gekleurd is (Alexa Fluor 488) en cellulaire mitochondriën gekleurd zijn met een rode kleurstof (MitoTracker Red CMXRos). Tijdens de prometafase zijn de microtubuli van de mitotische spindel nu vrij om het kerngebied binnen te gaan, en de vorming van gespecialiseerde eiwitcomplexen, kinetochores genaamd, begint op elk centromeer. Deze complexen hechten zich aan een subset van de spindelmicrotubuli, die dan kinetochormicrotubuli worden genoemd. Andere microtubuli in de spindel (niet vastgehecht aan centromeren) worden polaire microtubuli genoemd, en deze helpen de spindelstructuur te vormen en in stand te houden, samen met de astrale microtubuli, die buiten de spindel blijven.

De grens tussen profase en prometafase wordt bepaald door het snelle begin van fosforylering in de gehele kernlamina, teweeggebracht door activering van een enzym dat mitose-inducerend proteïnekinase (afgekort MPF) wordt genoemd. Het kernmembraancomplex valt uiteen in blaasjes, waardoor de gecondenseerde chromosomen bloot komen te liggen aan het uitdijende microtubulaire netwerk van de mitotische spil. Onder de optische microscoop kunnen de kernmembraanblaasjes, die vrijwel niet te onderscheiden zijn van soortgelijke opgesplitste delen van het endoplasmatisch reticulum, worden gevisualiseerd in het gebied rond de groeiende spil.

Als de kinetochore-microtubuli zich vasthechten aan hun receptoren op de kinetochores van de chromatiden, worden de chromosomen in een opgewonden beweging gebracht en bewegen ze snel heen en weer door de spanning die door de spil wordt uitgeoefend. Tegelijkertijd werken polaire microtubuli die van de centrosomen afkomstig zijn met elkaar samen om een netwerk van verbindingen tussen de chromosomen te vormen en de structuur van de mitotische spil verder tot stand te brengen. Kinetochores worden geassembleerd op het centromeer van elk chromatide om twee kinetochores per chromosoom te verkrijgen. Uiteindelijk zullen de kinetochore-microtubuli in de anafase de zusterchromatiden naar tegenovergestelde polen van de mitotische spil trekken om ervoor te zorgen dat elke dochtercel een volledige genetische aanvulling van chromosomen ontvangt.

De complexiteit van de relatie tussen kinetochores en de mitotische spil weerspiegelt de eis voor een nauwkeurige verdeling van het genetisch materiaal tussen de delende cellen. De meest voorkomende fout in mitose is het ontbreken van scheiding tussen de zusterchromatiden, waardoor een van de twee dochtercellen beide chromosoomkopieën krijgt. Deze fout, die ongeveer eenmaal per 100.000 celdelingen optreedt, kan zich voordoen als chromatiden zich niet aan de juiste spoelpool hechten of als een chromatidenpaar zich slechts aan één pool hecht. In sommige gevallen zijn de twee zusterchromatiden weliswaar correct in het mitotische spindelapparaat geassembleerd, maar lukt het eenvoudigweg niet om ze in de anafase te scheiden.