Mechanisme van peritoneale metastase

De eerste stap in de peritoneale metastase is exfoliatie van de eierstokkankercellen uit de primaire tumor naar de peritoneale holte. Voorwaarde voor deze stap is het verlies van cel-cel contact tussen de kankercellen. Zoals eerder vermeld, kan eierstokkanker ontstaan uit de epitheelcellen van de eileider of uit het epitheel van het ovariële oppervlak. Beide brengen de klassieke epitheliale marker epitheliaal cadherine (E-cadherine) tot expressie. E-cadherine speelt een sleutelrol in het gedrag van epitheliale cellen, de onderdrukking van tumoren en de weefselarchitectuur door zijn functie als cel-cel-adhesiemolecule. Het is met het actine-cytoskelet geassocieerd via α-, β- en γ-catenines. E-cadherine is direct betrokken bij de vorming van adherens juncties tussen aangrenzende epitheelcellen, maar het kan ook de vorming van tight junctions en desmosomen reguleren.

Als de kanker zich ontwikkelt van een goedaardige naar een kwaadaardige vorm, ondergaan de cellen een epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT). Dit gaat gepaard met moleculaire en morfologische veranderingen, waarbij de cellen hun epitheliale kenmerken verliezen en mesenchymale eigenschappen krijgen. Dit omvat een verlies van de compacte cel-tot-cel aanhechting, polariteit, en de kubusvormige vorm. De cellen worden meer spilvormig en beweeglijker. EMT gaat ook gepaard met een verandering in de expressie van epitheliale en mesenchymale markers. Een zeer belangrijk aspect van deze overgang is het verlies van expressie van E-cadherine en een gelijktijdige toename van de expressie van neurale cadherine (N-cadherine). Dit resulteert in een vermindering van de cel-cel interactie tussen kankercellen via hun adherens juncties en een toename van het vermogen van de kankercellen om te interageren met de normale stromale cellen die in de micro-omgeving aanwezig zijn. Bij eierstokkanker kan de expressie van E-cadherine transcriptioneel en post-transcriptioneel worden gereguleerd. Van ZEB-1, ZEB-2, Snail, en Slug is bekend dat ze E-cadherine onderdrukken en dat ze door verschillende externe signalen kunnen worden gereguleerd. De signaalwegen die EMT en E-cadherine expressie reguleren omvatten transformerende groeifactor β (TGF-β), epidermale groeifactor (EGF), hepatocyte groeifactor (HGF), endotheline-1 (ET-1), en botmorfogenetisch eiwit 4 (BMP-4) . Bovendien kan de miR-200 familie van micro-RNA’s ook indirect EMT reguleren door ZEB-1 en ZEB-2 te targeten, wat resulteert in de depressie van E-cadherine . Verminderde expressie van miR-200 familie resulteerde in een toename van de expressie van ZEB-1 en ZEB-2, die E-cadherine transcriptie onderdrukten en EMT induceerden in eierstokkanker.

Het verlies van E-cadherine expressie en de resulterende afname van de cel-cel hechting bevordert de verspreiding van de cellen in de peritoneale holte. Interessant is dat het verlies in E-cadherine expressie bleek te leiden tot een inductie van expressie van α5-integrine. α5-integrine vormt een heterodimer met β1-integrine dat bindt aan fibronectine en wordt daarom de fibronectine receptor genoemd. De inductie van α5-integrine verliep niet via de canonieke β-catenine-route. In plaats daarvan verliep de inductie via de epitheliale groeifactorreceptor (EGFR)/focal adhesion kinase (FAK)/mitogeen-geactiveerd eiwit kinase (MAPK) route. De toename van de fibronectinereceptorexpressie bleek de verspreide eierstokkankercellen te helpen zich te hechten aan het fibronectine dat wordt afgescheiden door de mesotheliale cellen die het omentum en peritoneum bekleden. Dit is een bewijs van hoe het verlies van E-cadherine – dat het loslaten vergemakkelijkt – gekoppeld is aan de voorbereiding van de cellen om zich opnieuw te hechten op de verre metastatische plaats.

Als de kankercellen eenmaal zijn losgelaten in de peritoneale vloeistof, heeft dit een aanzienlijke invloed op de prognose van de patiënt, zoals blijkt uit het recidiefpercentage van 29% bij stadium 1A eierstokkanker, vergeleken met 59% bij stadium 1C . Eens losgemaakt van de tumormassa, moeten de kankercellen echter verschillende uitdagingen aangaan om in de peritoneale vloeistof te overleven. De peritoneale vloeistof is het resultaat van de voortdurende afscheiding van vloeistoffen door de peritoneale haarvaten. Dit helpt bij het smeren van de aangrenzende organen in de peritoneale holte en maakt opname van oplosbare factoren door het peritoneum mogelijk. Een groot deel van het peritoneale vocht wordt via lymfedrainage teruggeleid naar de circulatie. Bij eierstokkankerpatiënten echter leidt de verhoogde lekkage van de bloedvaten, veroorzaakt door hoge niveaus van de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), in combinatie met de blokkering van de lymfevaten door kankercellen, tot de vorming van ascites. Deze ascites wordt maligne ascites genoemd wegens de aanwezigheid van zwevende kankercellen. De kwaadaardige ascites vergemakkelijkt de verspreiding van de kankercellen door de peritoneale holte.

De verspreide eierstokkankercellen die in de ascites zweven, hetzij als sferoïden of als afzonderlijke cellen, ontwikkelen resistentie tegen anoikis en krijgen kankerstamcel-achtige eigenschappen . Interessant was dat de eencellige populatie een groter percentage kankerstamcellen bleek te bevatten. De kankerstamcellen verrijkt uit ascites hebben een sterk verhoogd vermogen om muis xenograft tumoren te vormen . Net als kankerstamcellen zijn de drijvende sferoïden en enkele cellen resistent tegen chemotherapie. De compacte aard van de sferoïden dient als een extra fysieke barrière voor de chemotherapeutische middelen, het voorkomen van de binnenste cellen van blootstelling aan het geneesmiddel. Alles bij elkaar geeft dit aan dat de kankercellen die in de ascites drijven stam-achtig en chemoresistent zijn en het potentieel hebben om nieuwe metastatische tumoren in de buikholte te zaaien.

De sferoïden hebben verhoogde niveaus van E-cadherine en EpCAM en gelijktijdige verlaagde expressie van vimentine, matrix metalloproteinases (MMPs), en CD44 . De metastaserende kankercellen vertonen dus plasticiteit in termen van hun vermogen om heen en weer te schakelen tussen epitheliale en mesenchymale fenotypes naargelang van de vereisten van de verschillende stappen van metastase. Naast de kankercellen, heeft de ascites verschillende normale celtypes die samen de kwaadaardige ascites micro-omgeving vormen en de drijvende kankercellen ondersteunen. De belangrijkste niet-kankerceltypes omvatten kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs), mesotheelcellen, immuuncellen, mesenchymale stamcellen, en bloedplaatjes . Deze cellen kunnen geassocieerd zijn met de kankersferoïden of de afzonderlijke cellen. Ze kunnen ook op zichzelf bestaan, drijvend in de peritoneale vloeistof. Deze ondersteunende cellen produceren een milieu van factoren die de overleving van de kankercel en de daaropvolgende kolonisatie van de metastatische plaats bevorderen. Cellen zoals bloedplaatjes bieden ook bescherming tegen immuunbewaking door de kankercellen te omhullen.

Als ze met succes het drijven in de peritoneale vloeistoffen hebben overleefd, is het volgende doel van de metastaserende eierstokkankercellen zich te hechten aan de verschillende organen die in de peritoneale holte aanwezig zijn. Elektronenmicrofoto’s van doorsneden van normaal peritoneum en omentum hebben de architectuur van het mesothelium dat hen bedekt onthuld. Het mesothelium bestaat uit een monolaag van mesotheelcellen die zeer nauw aan elkaar vastzitten om een beschermende barrière te vormen. Deze mesotheliale cellen zorgen voor een glad oppervlak – door de afscheiding van glycosaminoglycanen en smeermiddelen – waardoor de normale coelomische beweging wordt vergemakkelijkt en infectie en aanhechting van kankercellen wordt voorkomen. De mesotheliale cellen kunnen diverse functies vervullen, zoals de afscheiding van ECM’s, groeifactoren en ontstekingsbevorderende cytokinen voor weefselherstel en -regeneratie, proteasen voor fibrinolyse, en het voorkomen van verklevingen. Ze zijn ook actief betrokken bij de verplaatsing van vloeistoffen en oplosmiddelen door de serosale holten.

Eerdere in vitro-experimenten toonden aan dat de eierstokkankercellen de retractie van de mesotheelcellen afdwingen bij aanhechting aan het mesothelium. Meer recent hebben Iwanicki et al. de rol aangetoond van de fibronectinereceptor (α5β1-integrine) die tot expressie komt op het oppervlak van de eierstokkankercellen, waardoor deze zich kunnen hechten aan de fibronectine die wordt afgescheiden op het oppervlak van de mesotheelcellen en de verplaatsing van de mesotheelcellen bevorderen door myosine-gemedieerde trekkrachten . Latere studies toonden aan dat de eierstokkankercellen met een mesenchymaal fenotype een grotere neiging hadden tot mesotheliale klaring. De fibronectine secretie door de mesotheliale cellen bleek te worden geïnduceerd door hun interactie met de metastaserende eierstokkankercellen. De TGF-β afgescheiden door de kankercellen activeerde een RAC1/SMAD-gemedieerde signaalweg in de mesotheelcellen, wat resulteerde in de transcriptionele upregulatie van het fibronectine gen en ook een EMT-achtig fenotype in de mesotheelcellen inleidde. Dit zou waarschijnlijk helpen bij de daaropvolgende mesotheliale klaring en kan ook mogelijk dienen als een bron van kanker-geassocieerde fibroblasten in de micro-omgeving van de metastatische tumor .

De verhoogde expressie van de fibronectine receptor in de ovariumkankercellen is ook gunstig in het koppelen van hechting aan groeifactor signalering om metastase te bevorderen. Remming van de interactie van α5β1-integrine op de kankercellen met de fibronectine op het oppervlak van het omentum en peritoneum in muizen xenograft modellen van eierstokkanker metastase resulteerde in een verminderde metastatische last in zowel preventie als interventie settings . Aangezien remming van α5β1-integrine ook angiogenese kan remmen, werd verder onderzocht of de effecten op metastase eigenlijk te wijten waren aan verstoring van de menselijke kankercel α5β1-integrine interactie met fibronectine of die van de muis endotheelcel α5β1-integrine. Het effect van een anti-murine α5β1-integrine-blokkerend antilichaam werd vergeleken met dat van het anti-humane α5β1-integrine-blokkerend antilichaam. Interessant genoeg vertoonde het muriene blokkerende antilichaam geen significant effect en bevestigde daarom de sleutelrol van de interacties van de kankercel α5β1-integrine met de fibronectine van de micro-omgeving in het bevorderen van metastasering van eierstokkanker. Verder onderzoek toonde aan dat de activering van α5β1-integrine resulteerde in de activering en fosforylering van het receptor tyrosine kinase c-Met onafhankelijk van zijn ligand-hepatocyte groeifactor (HGF) . Deze door hechting geïnduceerde activering van de groeifactor-receptor leidt tot verhoogde invasiviteit en groei door de daaropvolgende activering van de FAK/Src-signaalroutes in de kankercellen. De expressie van een constitutief actief FAK kan de remmende effecten van het α5β1-integrine-blokkerend antilichaam op de eierstokkankercellen teniet doen.

Een ander effect van de aanhechting van de eierstokkankercellen aan het oppervlak van het omentum is de verhoogde afscheiding van het extracellulaire protease MMP-2. Het splijt fibronectine en vitronectine aanwezig op het oppervlak van het mesothelium in kleinere fragmenten, wat de binding van de kankercellen aan deze ECM’s versterkt via hun specifieke integrinreceptoren α5β1-integrine en αvβ3-integrine, respectievelijk . Remming van MMP-2 in de eierstokkankercellen als preventieve maatregel remde hun hechting aan het omentum in naakte muizen. Echter, de gastheer MMP-2 speelde geen rol in dit proces zoals blijkt uit MMP-2 knockout xenograft experimenten in muizen.

Als de kankercellen zich eenmaal hechten aan de mesotheelcellen op het oppervlak van het omentum, beginnen zij aan een proces van aanpassing aan de nieuwe micro-omgeving van de plaats van metastase. Zoals blijkt uit de ECM-kankercel-interacties en hun gevolgen hierboven, zijn meer productieve wederzijdse interacties tussen de kankercellen en hun nieuwe micro-omgeving essentieel voor de succesvolle vestiging van de metastatische tumoren. De kankercellen moeten van overlevende anoikis, drijvend in de peritoneale vloeistof, overgaan tot aanhechtende groei in aanwezigheid van nieuwe ECM’s en groeifactoren die beschikbaar zijn in de micro-omgeving van het omentum en het peritoneum. Dit gaat gepaard met aanzienlijke veranderingen in de genexpressieprofielen van de koloniserende kankercellen en zou derhalve de activering/repressie impliceren van transcriptionele/translationele regulatoren die afhankelijk zijn van microenvironmentele signalen. Eén zo’n belangrijke micro-omgeving gereguleerde translationele regulator bleek het micro-RNA miR-193b te zijn. miR-193b is een tumoronderdrukkend micro-RNA dat werd gedownreguleerd in de metastaserende eierstokkanker na hun interactie met de mesotheliale cellen die het oppervlak van het omentum bedekken. Deze downregulatie bevorderde de groei en invasiviteit van de kankercellen in vitro, kolonisatie van het menselijk omentum ex vivo, en verminderde metastasering in muizen xenograften. Interessant is dat de miR-193b downregulatie werd geïnduceerd door de hypermethylering van zijn promotor als gevolg van de cross talk tussen de kankercellen en de mesotheliale cellen. De hypermethylering van de promotor werd gekatalyseerd door de verhoogde expressie van DNMT1 in de kankercellen, gestimuleerd door hun interactie met het mesothelium. miR-193b bleek rechtstreeks gericht te zijn tegen urokinase. Een afname in miR-193b expressie resulteerde in een verhoogde expressie van urokinase, wat de functionele effecten van miR-193b in het aansturen van metastatische kolonisatie van het omentum medieert.

Als de kankercellen zich aanpassen aan de nieuwe micro-omgeving van de metastatische site en beginnen te prolifereren, rekruteren ze ook interne en niet-existent normale cellen en converteren ze in de tumor-geassocieerde stroma of ‘geactiveerde stroma’ . Het is bekend dat de tumoren voor 10-50% uit niet-kankercellen of tumorstroma bestaan. De belangrijkste componenten van dit tumorstroma zijn de kankergeassocieerde fibroblasten (CAF’s), tumorgeassocieerde macrofagen (TAM’s), en andere immuuncellen, endotheelcellen, pericyten, adipocyten, extracellulaire matrixeiwitten, enz. Al deze stromale componenten zijn essentieel voor een succesvolle groei en progressie van de tumoren, aangezien zij een kritische bron zijn van groei- en tropische factoren, helpen bij het omzeilen van immuunbewaking, angiogenese, ECM-remodellering, invasiviteit, enz. Daarom zal het uiteindelijke succes van de kankercellen in het koloniseren van het omentum afhangen van hun vermogen om een actief tumorstroma te ontwikkelen.

De metastaserende eierstokkankercellen bleken de aanwezige normale fibroblasten in het basaal membraan van het omentum te rekruteren en hen te herprogrammeren in CAFs. Deze herprogrammering werd aangedreven door de verminderde expressie van miR-214, miR-31, en een verhoging van de expressie van miR-155 in de normale fibroblasten geïnduceerd door de kankercellen. De resulterende CAFs bevorderden de migratie, invasie en kolonievorming van ovariumkankercellen in vitro en tumorgroei en metastase in vivo. Interessant is dat CAFs terug omgezet konden worden in normale fibroblasten door de gecombineerde overexpressie van miR-214 en miR-31 en remming van miR-155. De micro-RNAs bewerkstelligden hun effecten via een reeks targets, waarvan de meeste geïdentificeerd werden als chemokines en cytokines. De belangrijkste mediatoren bleken CCL5 te zijn, dat een direct doelwit was van miR-214. Remming van CCL5 in naakte muizen geïnjecteerd met een mengsel van eierstokkankercellen en CAFs verminderde significant het vermogen van de CAFs om tumorgroei en metastase te bevorderen.

Een belangrijke en overvloedige cellulaire component van het omentum zijn adipocyten. Tot voor kort was er niet veel bekend over de directe rol van de omentale adipocyten in het bevorderen van uitzaaiing van eierstokkanker naar het omentum, hoewel het vaststaat dat het omentum een van de belangrijkste plaatsen van uitzaaiing van eierstokkanker is en dat het een overwegend vetweefsel is. De groep van Dr. Lengyel toonde verder aan dat de omentale adipocyten adipokines afscheiden die de uitzaaiing van de eierstokkankercellen naar het omentum bevorderen. De kankercellen konden vervolgens de metabole herprogrammering van de adipocyten induceren en lipolyse in hen induceren. De adipocyten induceerden op hun beurt de expressie van FABP4 – een vetzuurtransporter – in de kankercellen. Als gevolg hiervan nemen de kankercellen efficiënt de vrije vetzuren op die door de adipocyten worden vrijgemaakt en gebruiken deze als energiebron en bouwstenen om de tumorgroei aan te drijven. Dit verklaart waarom de omentumtumor gewoonlijk de grootste in de buikholte is en soms het hele omentum verandert in een vaste, harde omentaalkoek. Tegen die tijd zijn alle adipocyten uitgeput en gebruikt voor de groei van de uitgezaaide tumor.