DISCUSSION

Nucleïnezuuramplificatie met behulp van RT-PCR of andere technieken biedt een nauwkeurigere diagnose van EV meningitis dan eerder beschikbare technieken zoals virale cultuur. Nu deze gevoelige diagnostische technieken beschikbaar zijn, worden veel CSF specimens nu ingestuurd voor EV nucleïnezuur testen. Wij hebben het CSF profiel, met inbegrip van het aantal leukocyten en het proteïnegehalte, gecontroleerd om de prestatie van de EV RT-PCR die in ons laboratorium gebruikt wordt, te helpen beoordelen. We hebben nu de gegevens geanalyseerd van monsters die tussen 2001 en 2003 voor EV RT-PCR werden ingestuurd om de relatie tussen CSF parameters en de aanwezigheid van EV infectie van het centrale zenuwstelsel (CZS) opnieuw te evalueren. Tijdens één van die jaren was er een grote uitbraak van WNV in ons gebied, waardoor we de impact konden evalueren van de aanwezigheid van een andere neurotropische pathogeen op de relatie tussen afwijkingen in het CSF profiel en de mogelijke aanwezigheid van EV RT-PCR. Onze bevindingen kunnen nuttig zijn voor clinici en laboratoriummedewerkers die hun gebruik van EV nucleïnezuurtesten willen optimaliseren.

Het hoofddoel van onze studie was de relatie tussen het aantal leukocyten in de CSF en de resultaten van EV RT-PCR. Wij waren geïnteresseerd in het bepalen van de proportie patiënten met zowel een EV CNS infectie als een verhoogd CSF leukocyten aantal. Wij waren ook geïnteresseerd in het bepalen van het aandeel van patiënten met een verhoogd CSF leukocyten aantal dat verklaard kon worden door EV infectie. Onze gegevens tonen aan dat deze beide verhoudingen sterk beïnvloed worden door leeftijd. Het ontbreken van pleocytose in CSF monsters die positief waren voor EV RNA bleef grotendeels beperkt tot zuigelingen jonger dan 2 maanden en kwam in deze leeftijdsgroep vrij vaak voor (28%), waarschijnlijk als gevolg van de onrijpe immunologische toestand van deze patiënten. Het is verleidelijk om te speculeren dat een chemokine respons die nodig is voor het rekruteren van leukocyten naar de plaats van de infectie nog niet ontwikkeld was bij deze patiënten. Bij oudere patiënten had minder dan 2% van de patiënten met EV infectie van het CZS geen pleocytose. Omgekeerd kwam de bevinding van CSF pleocytose met een negatieve EV RT-PCR vaker voor bij stalen van oudere patiënten. Het is niet verrassend dat deze bevinding ook vaker voorkwam tijdens het seizoen waarin een aanzienlijke uitbraak van WNV-ziekte voorkwam in het gebied dat door ons laboratorium werd bediend.

Vorige kleinere studies hebben zich ook gericht op een vergelijking van EV RT-PCR resultaten en CSF parameters. Henquell et al. (5) rapporteerden over 61 patiënten met symptomen van meningitis en vergeleken EV kweek- en PCR resultaten met CSF bevindingen. Zesenvijftig van de 61 patiënten (92%) waren PCR-positief, maar 9 patiënten die >1,5 jaar oud waren, hadden een CSF-celaantal van <10 cellen/mm3 en waren PCR- of kweekpositief. In hun studie was de correlatie tussen pleocytose en EV RT-PCR positiviteit dus niet goed. Böttner et al. (2) rapporteerden over een cohort van 70 patiënten met symptomen van meningitis tijdens de zomer van 2000. In die studie waren 29 (46%) van de 61 EV RT-PCR-testen op CSF positief. Het aantal CSF-cellen varieerde van 2 tot 1.820 cellen/mm3, met een gemiddelde van 151. De auteurs meldden dat er geen verschillen waren in laboratoriumresultaten tussen de patiënten in hun studie die EV RT-PCR positief waren en zij die negatief waren, maar zij gaven geen gedetailleerde CSF celtellingen. De verklaring voor de verschillen tussen de resultaten van die studies en de huidige studie is niet duidelijk, maar het zou biologische verschillen kunnen weerspiegelen in de EVs die gedetecteerd worden of verschillende prestatiekenmerken van de EV RT-PCR assays.

Een van de interessante aspecten van de huidige studie is de aandacht te vestigen op de oorzaken van CSF pleocytose bij patiënten bij wie de EV RT-PCR assay negatief is. Een mogelijke verklaring is dat de assay mogelijk niet alle EV infecties detecteert. Wij kennen de feitelijke analytische (moleculaire) gevoeligheid van het Chemicon assay niet in termen van zijn vermogen om lage niveaus van viraal RNA te detecteren. Wij hebben de gevoeligheid onderzocht en zijn tot de bevinding gekomen dat deze in de orde van grootte ligt van 2,0 maal de 50% weefselkweek infectieuze dosis, maar wij weten niet hoeveel EV-genomen dit vertegenwoordigt, noch is bekend hoeveel niet-infectieuze deeltjes worden geproduceerd in een acute infectie in menselijke CSF. Het is echter onwaarschijnlijk dat dit de enige verklaring is, aangezien in onze studie 21 van 148 patiënten (14%) die ≤2 maanden oud waren en 169 van 549 patiënten (31%) die >2 maanden oud waren pleocytose hadden en EV RT-PCR negatief waren. Van de primers en de probe die in onze studie werden gebruikt is aangetoond dat ze op 6 na alle 64 bekende EV’s die mensen infecteren detecteren (13). Eén EV, coxsackievirus A15, was niet beschikbaar voor testen, en twee andere die niet gedetecteerd werden met deze primer en probe combinatie, echovirussen 22 en 23, zijn sindsdien geherclassificeerd als parechovirussen (16). De zes EV’s die niet werden opgespoord zijn epidemiologisch zeldzaam. Andere infecties, zoals HSV, EBV, en WNV, werden gediagnosticeerd bij sommige van de patiënten met pleocytose, maar vertegenwoordigden slechts 18 infecties of 23% van alle patiënten in deze studie met pleocytose en een negatieve EV RT-PCR in het jaar 2002 (n = 77). Het is mogelijk dat sommige van de overblijvende patiënten infecties hadden met andere infectieuze agentia, zoals parechovirussen (16). Bovendien kunnen sommige van de waargenomen gevallen van pleocytose in deze studie te wijten zijn geweest aan niet-infectieuze oorzaken van pleocytose, waaronder reacties op geneesmiddelen zoals cotrimoxazol, niet-steroïde anti-inflammatoire middelen en intraveneuze immunoglobuline. Bacteriële urineweginfectie is ook geïmpliceerd als een oorzaak van CSF pleocytose bij kinderen (18).

Het gebruik van CSF eiwit niveaus als een indicator van EV RT-PCR positiviteit werd overwogen. Uit de gegevens bleek echter dat het CSF-eiwitgehalte op zichzelf niet gevoelig of specifiek was en dat het evenmin de gevoeligheid of specificiteit verhoogde wanneer het samen met pleocytose werd gebruikt. De “receiver operating characteristic curves” toonden aan dat de specificiteit van de CSF-eiwitspiegel alleen nooit groter was dan 80% bij geen van de onderzochte cutoff-niveaus, en in geen enkele leeftijdsgroep of bij geen van de drie niveaus die we onderzochten, waren zowel de sensitiviteit als de specificiteit groter dan 80%. De beste correlatie tussen CSF proteïne niveaus en EV RT-PCR positiviteit trad op bij patiënten die >2 maanden oud waren bij 80% van de normale cutoff, waar de sensitiviteit 68% was en de specificiteit 78%.

De circulatie van WNV in de gemeenschap gedurende het EV seizoen 2002 was mogelijk een verstorende factor bij het gebruik van CSF markers als correlaten van EV RT-PCR positiviteit. De z-test gegevens van Tabel 33 bevestigen inderdaad dat er significante verschillen waren tussen de gegevens van de seizoenen 2001 en 2002 over de specificiteit van pleocytose alleen of pleocytose en/of verhoogd eiwitniveau als correlaten van EV RT-PCR positiviteit, misschien te wijten aan de aanwezigheid van WNV in St. Louis tijdens het seizoen 2002. In 2002 waren er 67 CSF specimens van patiënten die >2 maanden oud waren en pleocytose hadden die negatief waren door EV PCR. Hiervan waren er 10 (15%) positief voor WNV en 18 (27%) waren positief voor ofwel WNV of een ander virus. Indien al deze 18 vals-positieven uit de berekeningen van 2002 werden verwijderd, stegen specificiteit en PPV van respectievelijk 56% en 23% tot 63% en 29%. De specificiteit en PPV voor alle specimens van patiënten die in 2001 >2 maanden oud waren, bedroegen respectievelijk 62% en 66%. Het verwijderen van de vals-positieven die toe te schrijven waren aan de aanwezigheid van andere virussen verklaart nog steeds niet de daling in PPV van 2001 tot 2002. Er moeten andere onbekende factoren aan het werk zijn. De aanwezigheid van een andere oorzaak (infectieus of niet) van CSF pleocytose in de gemeenschap vermindert dus het vermogen van het laboratorium om EV-positiviteit te voorspellen op basis van CSF-bevindingen.

Naast het vestigen van de aandacht op andere CSF pleocytose-oorzaken dan EV-infectie, hebben de resultaten van deze studie twee praktische toepassingen. De eerste is dat laboratoria die EV RT-PCR uitvoeren de vergelijking van de RT-PCR resultaten met CSF celtellingen kunnen gebruiken om metrieken te ontwikkelen die gebruikt kunnen worden als onderdeel van een kwaliteitsborgingsprogramma voor die assay. Onze ervaring leert ons dat EV RT-PCR positief zou moeten zijn bij ongeveer 75% van de zuigelingen jonger dan 2 maanden met pleocytose van de liquor, bij ongeveer 65% van de zuigelingen en kinderen tussen 2 maanden en 18 jaar met pleocytose van de liquor, en bij ongeveer 25% van de patiënten ouder dan 18 jaar met pleocytose van de liquor. Deze cijfers zijn afgeleid uit de gegevens van de twee seizoenen waarin het WNV niet of nauwelijks voorkwam. Bij de analyse van gegevens in verband met deze metriek moet rekening worden gehouden met de circulatie van bekende of nieuwe arbovirussen of andere virussen die meningitis kunnen veroorzaken, omdat dit zal leiden tot een daling van het percentage patiënten met pleocytose die een positief EV RT-PCR-resultaat hebben. Laboratoria die niet aan deze norm voldoen, kunnen er baat bij hebben de analytische gevoeligheid van hun assay te onderzoeken, maar moeten ook alert zijn op de mogelijke aanwezigheid van andere agentia die CSF-pleocytose kunnen veroorzaken.

Een tweede metriek die voor kwaliteitscontrole kan worden gebruikt, is dat de EV RT-PCR-assay negatief moet zijn bij ongeveer 98% van de patiënten ouder dan 2 maanden bij wie CSF-pleocytose ontbreekt, en bij ongeveer 70% van de patiënten jonger dan 2 maanden bij wie geen pleocytose optreedt. De detectie van EV RNA bij een groter percentage patiënten zonder pleocytose zou laboratoria ertoe moeten aanzetten na te gaan of er sprake kan zijn van PCR-verontreiniging. Er moet echter opgemerkt worden dat deze percentages waarschijnlijk zullen verschillen van regio tot regio, van patiëntenpopulatie tot patiëntenpopulatie, van diagnosetest tot diagnosetest en van seizoen tot seizoen, mogelijk afhankelijk van het EV dat circuleert.

De tweede praktische toepassing van de bevindingen van deze studie is dat laboratoria deze gegevens kunnen gebruiken om criteria op te stellen om de efficiëntie van EV RT-PCR testen te maximaliseren. Bijvoorbeeld, omdat de afwezigheid van pleocytose een voorspellende waarde heeft van meer dan 98% voor een negatief RT-PCR resultaat bij patiënten ouder dan 2 maanden, kunnen laboratoria ervoor kiezen om een cutoff te bepalen voor EV RT-PCR testen gebaseerd op de aan- of afwezigheid van pleocytose. Gebruik makend van de gegevens van deze studie, zou de toepassing van deze cutoff geleid hebben tot het uitsluiten van 223 van 549 specimens (gebaseerd op de 549 specimens van patiënten die >2 maanden oud waren en waarvoor CSF-celgetallen beschikbaar waren), waarbij slechts 3 positieve specimens (1,3%) niet gedetecteerd zouden zijn, die zich in de uitgesloten groep van 223 monsters zouden bevinden. De drie patiënten met EV-infectie maar zonder pleocytose waren 5 maanden, 10 jaar en 15 jaar oud. Eén van deze patiënten (de 10-jarige) werd verdacht van meningitis door EV op grond van een stijve nek, maar de andere twee hadden symptomen die minder duidelijk in verband werden gebracht met meningitis. De 10-jarige patiënt zou waarschijnlijk zijn getest op EV op basis van klinische verdenking in plaats van pleocytose van de liquor, maar de andere twee zouden misschien niet zijn getest. Voor alle drie de gevallen had het positieve EV PCR-resultaat geen significante invloed op de behandeling van de zaak. Indien een maatregel zoals wij hebben voorgesteld wordt aangenomen, bevelen wij aan deze toe te passen op patiënten ouder dan 2 maanden en ervoor te zorgen dat er een mechanisme bestaat dat het testen mogelijk maakt in individuele gevallen met een sterke klinische verdenking op EV-infectie, ongeacht de leeftijd van de patiënt of de aanwezigheid van pleocytose van de CSF. Het is duidelijk dat een screeningsprogramma op basis van pleocytose van de liquor alleen praktisch is voor laboratoria die zo snel toegang hebben tot gegevens over het aantal liquorcellen dat de toepassing van het screeningscriterium de uitvoering van de test niet zou vertragen. Eerdere studies hebben duidelijk aangetoond dat EV-tests zeer tijdig moeten worden uitgevoerd om van invloed te kunnen zijn op de klinische besluitvorming (14).