DISCUSSION

In deze studie presenteren we SAXS-oplossingsstructuren voor Hb en Hb geconjugeerd met twee of zes tot zeven kopieën van 5-kD PEG. Dit is het eerste voorbeeld van een 3D structuurbepaling van een PEG-geconjugeerd hemoglobine, zij het bij een lage resolutie. De belangrijkste bevindingen van deze studie zijn: i) PEG-conjugatie veroorzaakt geen grote vervorming van de tertiaire structuur van Hb (bij deze resolutie), maar de quaternaire structuur lijkt verdicht; ii) een deel van de PEG-ketens komt in holtes tussen de Hb-subeenheden, een deel blijft dicht bij het eiwitoppervlak, en de rest steekt weg van het oppervlak; iii) PEGylering verandert het bolvormige Hb-molecuul in een langgerekte structuur met twee of zes geconjugeerde PEG’s; iv) PEG-conjugatie leidt tot afstoting tussen de PEG-geconjugeerde Hb-moleculen, veroorzaakt door de PEG-laag die het eiwit Hb omgeeft, wat tot uiting komt in een duidelijk concentratie-effect in de SAXS-gegevens.

De experimentele verstrooiing van Hb past goed bij de berekende curve uit de kristalstructuur van oxyHb, terwijl de deoxyHb kristalstructuur een slechtere fit oplevert. Zowel P5K2 als P5K6 zijn geconjugeerd bij Cys-β93 naast het proximale His-β92, dat het enige residu is in de β-subeenheden van Hb dat direct gecoördineerd is met het heemijzer. Het lijkt waarschijnlijk dat de aanhechting van een 5-kD PEG lokale, kleine structuurvervormingen van de heemzak van de β-subeenheid veroorzaakt die niet detecteerbaar zijn bij deze resolutie (∼12 Å). Dit wordt ondersteund door studies naar de kinetiek van heemverlies die 5 keer zo hoog is voor de β-subeenheid van P5K6 in vergelijking met niet-geconjugeerd Hb, terwijl de α-subeenheden een vergelijkbare kinetiek vertonen als Hb (8). In overeenstemming met deze interpretatie toonden 1H NMR studies van een PEG-geconjugeerd Hb, dat in chemische structuur vergelijkbaar is met het hier bestudeerde P5K6, een verschuiving in het proximale histidine van de β- maar niet α-subeenheden (28). Bovendien bevinden residuen in de omgeving van Cys-β93 zich in een conformationeel plastisch gebied dat direct gekoppeld is aan de allosterische eigenschappen van Hb (29,30).

Modificatie van Cys-β93 residuen met N-ethyl maleimide alleen veroorzaakt een verlies in coöperativiteit, en dit effect, samen met verdichting van de quaternaire structuur, kan het schijnbare verlies in coöperativiteit in Hemospan verklaren (5). De quaternaire beweging zou beperkt kunnen zijn, waardoor slechts een gedeeltelijke overgang tussen de R- en T-toestand of een tussenliggende quaternaire structuur ontstaat. Een dergelijk effect is eerder overwogen om de kinetiek van O2 binding aan Hemospan te interpreteren (7).

Gezien het feit dat de groothoek gedeelten van de verstrooiing van Hb en PEG-Hb samenvallen, kunnen significante tertiaire/secundaire structuur veranderingen als gevolg van PEGylering worden uitgesloten, en onze resultaten wijzen dus op een meer compacte quaternaire structuur van het PEG-gemylateerde eiwit. Dit kan worden verklaard door een gedeeltelijke dehydratatie van de intersubunit interfaces veroorzaakt door de PEG-ketens, die zich, nogal onverwacht, gedeeltelijk in het inwendige van de PEG-Hbs bevinden. De quaternaire structuur van oxyHb creëert een centrale holte tussen de vier subeenheden van hemoglobine. Deze holte biedt plaats aan ten minste 80 watermoleculen, zoals blijkt uit de hoge-resolutie kristalstructuur van oxyHb (27). Het volume is dus voldoende voor PEG om het raakvlak tussen de subeenheden binnen te dringen en de watermoleculen in het inwendige van het tetrameer te verdringen. Bovendien staat PEG erom bekend dehydratie te veroorzaken en wordt het vaak gebruikt als cosolvent voor eiwitkristallisatie. In combinatie met de verplaatsing van watermoleculen in de centrale holte kan een algemene dehydratatie bijdragen aan de compacte quaternaire structuur van PEG-Hbs. Deze conclusie is consistent met moleculair-dynamische simulaties die een correlatie hebben aangetoond tussen de mate van PEGylering en het moleculaire volume van PEG-Hb, met een overeenkomstige verplaatsing van watermoleculen uit de Hb-structuur (31).

Aangezien het grootste deel van de PEG-ketens zich buiten Hb bevindt, komen onze resultaten overeen met eerdere studies die aantonen dat PEG bij voorkeur van eiwitten wordt geweerd door sterische uitsluiting (32). Bovendien, maar in competitie met uitsluitingskrachten, is aangetoond dat PEG interageert met niet polaire eiwit oppervlak residuen (32), en interactie van 5-kD PEG is gerapporteerd voor hydrofobe clusters op het oppervlak van cytochroom c (33). De hydrofobiciteitsscore voor Hb werd berekend volgens Kyte en Doolittle (34) (Fig. 6), waarbij de residunummers zijn uitgelijnd met spiraalvormige segmenten. Een gebied van bijzonder belang in mogelijke PEG-Hb interacties is over de relatief hydrofobe G-H schroeflijnen op de α1β1 verpakking contacten tussen dimers. Onze modellen tonen oppervlakte-interacties van PEG met Hb, hoewel de resolutie onvoldoende is om de betrokken Hb-residuen of hun polariteit te bepalen. Analyse van SAXS spectra opgenomen bij een relatief hoge eiwitconcentratie laat een duidelijk concentratie-effect zien voor zowel P5K2 als P5K6, terwijl dit effect vrijwel afwezig is in niet-geconjugeerd Hb. Zoals verwacht kan worden, is het concentratie-effect meer uitgesproken voor P5K6 dan voor P5K2, wat suggereert dat de introductie van extra PEG-ketens resulteert in een betere afscherming van het Hb-molecuul, ook in overeenstemming met moleculaire dynamica berekeningen van theoretische PEG-geconjugeerde Hbs (31).

Intuïtief zou men verwachten dat de PEG-Hbs dezelfde vorm hebben als het niet-gePEGyleerde Hb, maar hier laten we zien dat de vorm van een PEG-geconjugeerd eiwit niet wordt bepaald door die van het kerneiwit. De niet-sferische oplossingsvorm van de PEG-Hbs werd niet verwacht en levert nieuwe informatie op waarmee de diffusieconstanten van PEG-Hb berekend kunnen worden met behulp van de Stokes-Einstein vergelijking. Wij hebben simulaties gerapporteerd van zuurstoftransport door celvrije Hbs, inclusief PEG-Hb, waarbij bleek dat de moleculaire diffusie van het Hb een kritische factor is in het totale zuurstoftransport (35). Hoewel de conclusie klopt, werd in die studie de vereenvoudigende aanname gebruikt dat de Hb moleculen bolvormig waren. Aangezien de SAXS-oplossingsstructuur deze aanname tegenspreekt, kunnen nu correcte molecuulafmetingen worden gebruikt om nauwkeuriger simulaties te geven.

Daarnaast, hoewel zowel P5K2 als P5K6 vergelijkbare vormen en totale afmetingen hebben, levert het verschil in het afstotende effect van de deeltjes in oplossing een zeer kritische eigenschap op die een aantal van de positieve effecten van PEG-gemylateerde Hbs in vivo kan verklaren. De algemeenheid van deze waarnemingen kan worden toegeschreven aan de gehechte PEG-ketens en suggereert dat het concentratie-effect een algemeen gevolg is van PEG-conjugatie. Bijgevolg kan men in vivo veronderstellen dat dit effect niet alleen intermoleculaire interacties tussen aangrenzende PEG-geconjugeerde eiwitten voorkomt, maar ook tussen geconjugeerde en niet-geconjugeerde eiwitten of zelfs cellulaire structuren.

Een aantal algemene voordelen, zoals een verhoogde intravasculaire retentietijd, verminderde immunogeniciteit en verbeterde oplosbaarheid, wordt vaak in verband gebracht met de hechting van een PEG-polymeer aan een eiwit. Bijvoorbeeld, het hechten van een 40-kDa vertakt PEG polymeer aan interferon-β-1b verbeterde de circulerende halfwaardetijd van 1,1 uur voor het niet-geconjugeerde eiwit tot 9,4 uur voor het PEG-geconjugeerde geneesmiddel; bovendien verminderde het hechten van PEG drastisch de immunogeniciteit van het eiwit en de neiging tot aggregatie (4). Het vermogen van PEG-Hb om andere eiwitten of cellen binnen zijn uitgesloten volume uit te sluiten is bijzonder kritisch bij het ontwerp van zuurstoftherapieën. Op hemoglobine gebaseerde producten worden geoptimaliseerd om de circulatietijd te verlengen, terwijl de toxiciteit tot een minimum wordt beperkt of geëlimineerd. Dit resultaat is consistent met de verlengde circulatoire halfwaardetijd van Hemospan, die ∼20 uur bedraagt in afwezigheid van hemoglobinurie (14), vergeleken met de zeer snelle renale klaring van ongemodificeerd, celvrij Hb (36). Verlenging van de circulatietijd van Hemospan kan ontstaan als het niet bindt aan de macrofaag CD163 receptor, een Hb scavenger die een progressief afnemende binding vertoont van gepolymeriseerd Hb met toenemende grootte (37). Studies met Hemospan in dit systeem zijn aan de gang. Bovendien kan afstoting van PEG-Hb van andere immuuncellen van cruciaal belang zijn om ontstekingsreacties te voorkomen. De heersende theorieën over celvrije hemoglobine-geïnduceerde vasoconstrictie zijn dat de Hb-moleculen dicht bij het endotheel komen (38) of over het endotheel extravaseren (39), waarbij beide het NO-vangen efficiënter zouden maken, wat zou leiden tot een verhoging van de vasculaire tonus en negatieve neveneffecten van hypertensie en verminderde perfusie (40). Het blijft speculatief op dit punt, maar de afstotende aard van de PEG-modificatie kan de interactie met de oppervlakteglycocalyx van endotheelcellen verminderen; het afstotende effect biedt dus een verklaring voor de verminderde vasoactiviteit met Hemospan (10).

Deze nieuwe inzichten uit deze SAXS-analyse kunnen nu worden gebruikt om PEG-Hbs te ontwerpen voor maximale of optimale afstotingseffecten en deeltjesgrootte en PEG-conformaties. De intermoleculaire afstotingskrachten nemen aanzienlijk toe met de totale massa van geconjugeerde PEG’s met dezelfde polymeerlengte (10 vs. ∼30 kD voor P5K2 versus P5K6), een effect dat niet werd voorspeld door veranderingen in moleculaire vorm en/of afmetingen. Dus moeten oplossingsconformaties van de geconjugeerde PEGs, waaronder de interactie met Hb, andere PEG polymeren, en de omringende waterlagen, een grote rol spelen in het afstotingseffect.

Effectieve PEG-lengtes worden gedefinieerd door de Flory-dimensie, RF, die wordt bepaald uit de effectieve lengte van een oxyethyleen-eenheid, a = 3.5 Å (41), en het aantal eenheden per polymeer, N (42-44):

De relatieve afmetingen van RF en de afstand tussen PEG-entingplaatsen, DG, op een oppervlak bepalen de secundaire structuur van het geënte PEG-polymeer: voor DG > RF kan het PEG-polymeer zich over het geënte oppervlak in zichzelf vouwen, waardoor een “paddestoel”-conformatie ontstaat; voor DG < RF worden de PEG’s verlengd als gevolg van sterische interacties tussen PEG-ketens om een “borstel”-conformatie te vormen; en bij DG ≈ RF bevinden de PEG’s zich in een “paddestoel-naar-borstel”-overgangsfase (45). Voor 5-kD PEG is N = 113 en RF ∼ 60 Å. Aangezien de half-maximale omtrek DG op het Hb oppervlak van de ene Cys-β93 naar de andere aan de symmetrisch tegenovergestelde zijde van Hb ∼110 Å is, is DG > RF, waardoor een paddestoelconformatie van de geënte PEG polymeren in P5K2 mogelijk is. Dit wordt weerspiegeld in de PEG-kenmerken van de SAXS-structuur van P5K2, die een algemene ellipsoïdale vorm vertonen met Dmax = 115 Å. Berekening van de maximale diameter voor P5K2 met behulp van de Flory-dimensie voor 5-kD PEG levert een molecuul op met Dmax ∼ 190 Å (d.w.z, Hb diameter = 70 Å + PEGs, 2 × 60 Å), waarmee een schatting wordt gegeven voor de paddestoelconformatie van de PEG-ketens op P5K2 die zich vouwen tot ∼60% van hun volledige Flory afmetingen.

Het meer met PEG gecoördineerde P5K6 molecuul bevat de twee specifieke aanhechtingsplaatsen (Cys-β93) en nog eens vier tot vijf PEG geënte plaatsen. De SAXS-oplossingsstructuur impliceert dat de PEG-ketens van P5K6 een grotere sterische interactie hebben om een nog meer langgerekte vorm te vormen in vergelijking met P5K2 (Fig. 4). Bij een benadering waarbij de PEG-ketens gelijkmatig over het oppervlak van Hb verdeeld zijn, is DG verlaagd tot ∼55 Å, en DG ≈ RF, wat duidt op een meer verlengde PEG-conformatie, maar nog steeds in een paddestoel-naar-borstel overgang. Met behulp van de maximale Flory dimensie vergeleken met de gemeten Dmax = 130 Å, blijken de 5-kD PEG ketens op P5K6 zich te vouwen tot ∼70% van hun volledige Flory dimensie, consistent met een toename in PEG uitbreiding in P5K6 vergeleken met P5K2 door sterische restricties.

Door directe bepaling van de deeltjesgrootte door SAXS in combinatie met Flory analyse, hebben we voorspeld dat P5K6 zich in een paddestoel-borstel overgang bevindt en dus niet ontworpen is om zijn maximale deeltjesgrootte te bereiken wanneer de geconjugeerde PEGs volledig verlengd zijn. Nieuwe PEG-Hb moleculen kunnen ontworpen worden voor grotere deeltjes, zodanig dat DG < RF ofwel door: 1) een sterker geconjugeerd Hb te creëren met meer PEG-aanhechtingsplaatsen, waardoor DG afneemt, of 2) de PEG-lengte te vergroten, waardoor RF toeneemt. Verdubbeling van de grootte van PEG tot 10 kD (d.w.z. P10Kx, waarbij x het aantal conjugatieplaatsen is), verhoogt de RF tot ∼90 Å, wat volgens onze voorspelling een paddenstoelconformatie zou opleveren in P10K2, maar een vollere borstelconformatie zou benaderen in P10K6. Het is echter onbekend hoe het verlengen van de PEG-polymeerlengtes de sterische interacties tijdens de chemische conjugatiereactie tussen PEG en Hb verandert, en daarom is een experimentele praktijk met reactieratio’s in combinatie met SAXS-studies om het overgangspunt van paddestoel naar borstel te verifiëren, gerechtvaardigd.