Resultaten en Discussie

De driedimensionale structuur van Mal d 1.0101 bestaat uit een gebogen, zevenstrengs antiparallelle β-sheet (β1-β7) die een lange helix aan de C-terminus van het eiwit (α3) en twee opeenvolgende korte helixen (α1, α2) omvat (Figuur 11). De randen van de β-sheet worden gevormd door de strengen β1 en β2, die verbonden zijn door de helices α1 en α2 die een V-vormige steun vormen voor het C-terminale deel van helix α3. In totaal bevat Mal d 1 ca. 35% β-sheet en ca. 25% helicale structuur, hetgeen goed overeenkomt met secundaire structuurschattingen op basis van infrarood en circulair dichroïsme.33-35 Zoals in andere eiwitten van de PR-10 familie zijn de strengen β2 en β3 verbonden door een glycine-rijk lusmotief (Gly46-Asn47-Gly48-Gly49-Pro50-Gly51). Samen creëren deze structurele elementen de grote interne holte die typisch is voor de canonieke PR-10 vouwing. Uit figuur 11B blijkt dat in ons NMR-structuurensemble van Mal d 1 de secundaire structuurelementen zeer goed gedefinieerd zijn en conformationeel homogeen zijn in alle 20 structuurmodellen. Slechts licht verhoogde niveaus van conformationele heterogeniteit worden waargenomen voor sommige van de oplosmiddel-blootgestelde lussen die secundaire structuurelementen en de C-terminus van het eiwit verbinden.

Een eigenaardig kenmerk van de PR-10 vouwing is de grote interne holte.In Mal d 1.0101, is het volume van deze holte36 ca. 2230 Å3, wat vergelijkbaar is in grootte met die van andere PR-10 eiwitten.5 Net als in het berkenstuifmeelallergeen Bet v 1 en andere homologe voedselallergenen, is in Mal d 1 het merendeel van de aminozuren die het oppervlak van de holte vormen hydrofoob (Figuur Figuur 22). Een groot deel van het oppervlak van de binnenholte wordt gevormd door aminozuurresiduen in de β-sheet waarvan de hydrofobe zijketens zich aan de binnenkant van het eiwit bevinden (Ile56 (β3), Val67(β4), Ile71 (β4), Tyr81 (β5), Tyr83 (β5),Leu85 (β5), Ile98 (β6), Tyr100 (β6), Ile113 (β7))samen met naar binnen gerichte residuen in de lange amfifiele helixα3 (Val132, Val134, Ala139, Leu142, Phe143, Ile146), de twee korte helices α1 (Phe22, Val23) en α3 (Ala26, Ile30), en lusregio’s (Ile38, Phe58, Tyr64, Ala90). Bovendien bevinden zich enkele polaire en geladen zijketens aan de binnenkant van het molecuul en maken deel uit van het oppervlak van de holte, zoals Asp27 (α2), His69 (β4), Ser115 (β7), en Lys138 (α3), zodat de holte zelf eigenlijk amfifiel is, zoals eerder opgemerkt voor het belangrijkste berkenpollenallergeen, Bet v 1.37 In kristalstructuren van andere PR-10 eiwitten wordt de holte ingenomen door water, amfifiele ligandmoleculen, of componenten van de kristallisatiebuffer.5 Voor Mal d 1 is het momenteel niet bekend of liganden specifiek aan de holte binden of wat de biologische functie van ligandbinding zou kunnen zijn.

(A) Interne holte van Mal d 1.0101, gekleurd volgens de lipofiele potentiaal zoals geïmplementeerd in MOE32 , waarbij de hydrofiele gebieden blauw en de lipofiele gebieden geel zijn gekleurd. (B) Oppervlaktevoorstelling van de structuur van de oplossing met de laagste energie van Mal d 1,0101. De twee amfifiele ingangen tot de interne holte zijn aangegeven als ε1 (tussen de N-terminal van helix α3 en de lussen die de strengen β3-β4 en β5-β6 verbinden) en ε2 (tussen de rand van deβ-sheet en de C-terminal van helix α3).

De interne holte in Mal d 1 kan worden bereikt door twee openingen (Figuur Figuur 22). Eén ingang tot het eiwitinterieur, ε1, wordt gevormd door residuen in de N-terminale helft van helix α3 (His131, Val134) samen met de lussen die de strengen β3-β4 (Gln63, Tyr64) en de strengen β5-β6 (Asp89) verbinden. Samen vormen deze aminozuren een amfifiele toegangsweg tot het eiwitinterieur. Een tweede amfifiele toegang, ε2, is aanwezig aan de rand van de β-sheet tussen helix α3 (Lys136, His140, Lys144, en Glu147) en streng β1 (Asn7, Phe9,en Ser 11). In de NMR-oplossingsstructuren van Mal d 1 wordt deze toegangsroute gedeeltelijk belemmerd door de zijketen van His140. Merk op dat ingangen tot de interne holte op vergelijkbare plaatsen ook zijn beschreven voor andere leden van de PR-10 eiwitfamilie.5

Figuur Figuur 33 toont een vergelijking van Mal d 1 met Bet v 1 en berkenpollen-gerelateerde voedselallergenen uit de PR-10 familie waarvan de structuren tot nu toe zijn bepaald. Ondanks het feit dat de sequentie-identiteiten tussen deze eiwitten in sommige gevallen slechts iets hoger zijn dan 50%, zijn hun driedimensionale structuren over het algemeen zeer vergelijkbaar, met rmsd-waarden voor de secundaire structuren van de ruggengraat die typisch lager zijn dan 2 Å.38 In het licht van de waargenomen immunologische kruisreactiviteit tussen Mal d 1 en het belangrijkste berkenstuifmeelallergeen, Bet v 1, is de structuurvergelijking van deze twee eiwitten van bijzonder belang. De afstand tussen Mal d 1.0101 en de hyperallergene isovorm Bet v 1.0101 (61% sequentie-identiteit) van het berkenstuifmeelallergeen is 2,13 Å (1,70 Å voor secundaire structuurelementen). Opgemerkt moet worden dat Mal d 1 en Bet v 1 in lengte één aminozuur verschillen, en dat er uiteenlopende veronderstellingen zijn gemaakt over de plaats van het hiaat in Mal d 1. Op basis van sequentie-afstemming van PR-10 voedselallergenen is voorgesteld dat ofwel de lus vlak voor39,40 of vlak na4,34,41,42 streng β7 één residu korter is in Mal d 1. Onze oplossingsstructuur laat zien dat de lus vlak voor streng β7 degene is die in Mal d 1.0101 korter is. De strengen β6 (Glu96-Val105 in zowel Mal d 1.0101 als Bet v 1.0101) en β7 (Ser111-Thr121 in Mal d 1.0101 en Ser112-Thr122 in Bet v 1.0101) nemen identieke posities in en hebben gelijke waterstofbruggenpatronen in de antiparallelleβ-sheets van deze eiwitten. Zij zijn verbonden via lussen bestaande uit respectievelijk vier residuen (Cys-Gly-Ser-Gly in Mal d 1) en vijf residuen (Thr-Pro-Asp-Gly-Glyin Bet v 1), hetgeen een klein structureel verschil oplevert in deze lussegmenten tussen de twee eiwitten.

Mal d 1 staat erom bekend een neiging tot cysteïne-gemedieerde hybridisatie te vertonen, zoals voor de isovorm Mal d 1.0108 is aangetoond met behulp van niet-reducerende gelelektroforese en grootte-extractiechromatografie.35 Net als Mal d 1.0108 bevat de isovorm Mal d 1.0101 een enkel cysteïneresidu, Cys107. In de driedimensionale oplossingsstructuur van Mal d 1.0101 bevindt Cys107 zich aan het C-terminale uiteinde van streng β7, met zijn zijketen georiënteerd naar het eiwitoppervlak. Om de oligomerisatie toestand van Mal d 1.0101 te bepalen onder de condities die we gebruikten voor de NMR structuurbepaling (pH 6.9, 10 mM natriumfosfaat, 14 mol equivalenten van l-ascorbinezuur, 298 K) voerden we gepulste-veldgradiënt NMR diffusie-experimenten uit. We verkregen een waarde van 21,6 ± 0,8 Å voor de hydrodynamische straal van Mal d 1.0101, die vergelijkbaar is met de hydrodynamische straal van monomeer Bet v1.0101 (20,1 Å) onder vergelijkbare experimentele condities.21 Dit is consistent met onze waarneming dat, gebruikmakend van dezelfde buffer, Mal d 1.0101 elueert uit een maatscheidingskolom met een retentietijd die vrijwel identiek is aan die van Bet v1.0101. Deze resultaten werden verder geverifieerd door FT-ICR massaspectrometrie, waaruit blijkt dat Mal d 1.0101 geen dimeren of aggregaten van hogere orde vormt.

De NMR oplossingsstructuur van Mal d 1 laat zien dat dit eiwit bestaat uit een sterk gebogen antiparallelle β-sheet en drie α-helixen die een grote interne holte vormen, zeer vergelijkbaar met die van anderePR-10 eiwitten.5 Dit komt overeen met de waargenomen immunologische kruisreactiviteit tussen Mal d 1 en het belangrijkste berkenstuifmeelallergeen, Bet v 1, en andere voedselallergenen van de PR-10 eiwitfamilie.4,43 Bij de meeste patiënten is Betv 1 de sensibiliserende stof, terwijl Bet v 1-specifieke IgE-antilichamen vervolgens kruisreageren met Mal d 1 en een allergische reactie uitlokken, zoals blijkt uit de klinische waarneming dat appelallergie zich pas ontwikkelt na het begin van berkenpollenose.44

Volgens deze lijnen toonden kruisremmingsexperimenten van Mal d 1usingsera van appelallergische patiënten aan dat Mal d 1 IgE-epitopen deelt met het belangrijkste berkenstuifmeelallergeen, Bet v 1.4,43 Vanuit een structureel perspectief is er beperkte informatie beschikbaar over de precieze aard van de bindende epitopen van Mal d 1 en Bet v 1. Gedetailleerde structurele informatie over een sequentieel discontinu (d.w.z, conformationele) B-cel epitoop in Bet v 1 werd verkregen door cokristallisatie van de bijzondere vorm Bet v 1.0112 met een antigeen-bindend fragment (Fab) afgeleid van de murine monoklonale IgG-antistof BV16.45 Deze epitoop wordt gevormd door het segment tussen Glu42 en Thr52 (met inbegrip van de glycine-rijke lus motief tussen strengen β2 en β3), samen met Arg70, Asp72, His76, Ile86, en Lys97 van Bet v 1, die ongeveer 10% (≈900 Å2) van het gehele oppervlak van de eiwitten. Binding van BV16 aan dit epitoop vermindert serum-IgE-interacties meetbaar, wat aangeeft dat IgE en monoklonaal IgG BV16 concurreren om overlappende bindingsoppervlakken op Bet v 1.46 Bovendien verminderde mutatie van een centraal residu (Glu45→Ser) de IgE-bindingscapaciteit van Bet v 1 aanzienlijk, wat het belang van dit specifieke epitoop voor interacties met IgE bevestigt.46

Figuur Figuur44A toont het moleculaire interactieoppervlak dat correspondeert met het BV16-epitoop in het appelallergeen. In Mal d 1 vormen deze residuen een aaneengesloten vlek op het oppervlak samen met een iets verder gelegen residu (Glu76), dat qua vorm en grootte overeenkomt met het BV16-epitoop van Bet v 1. Bovendien zijn de bijdragende aminozuren grotendeels geconserveerd tussen Mal d 1 en Bet v 1. Dertien van de 16 aminozuren in de BV16-epitoop zijn identiek, terwijl slechts drie residuen verschillend zijn in Mal d 1.0101 en Bet v 1.0101 (figuur 44B). Deze gegevens leveren dus een structurele rationale voor de waargenomen allergische kruisreactiviteit tussen berkenstuifmeel en appelallergenen. Interessant is dat uit mutatiestudies blijkt dat het vermogen van Mal d 1 om serum IgE van patiënten met berkenstuifmeelallergie te binden kan worden vergroot door de gelijkenis van de BV16-epitoop in Mal d 1 met die van Bet v 1 te vergroten, wat erop wijst dat deze aminozuren inderdaad betrokken zijn bij de binding van Bet v 1 specifiek aan Mal d 1.39

(A) Conformationele epitopen van Mal d 1. Aminozuurresiduen die overeenkomen met het moleculaire interactieoppervlak tussen monoklonaal IgG BV16 en Bet v 1.0112 (residuen Glu42-Thr52, Arg70, Asp72,Glu76, Ile86, en Lys97 in Mal d 1.0101) zijn in blauw gekleurd.45 Aminozuurposities waarvan is aangetoond dat ze cruciaal zijn voor IgE herkenning van Mal d 1 in mutatieanalyses (Thr10, Ile30,Thr57, Ser111, Thr112, en Ile113) zijn groen gekleurd (Ile30 en Ile113 bevinden zich in het inwendige van het eiwit en dragen niet bij aan het oppervlak).13,34 (B) Aminozuur overeenkomsten tussen Bet v 1.0101 en Mal d 1.0101, gebruik makend van een kleur gradiënt van lila (sterk gelijkend) tot groenblauw (sterk verschillend). Epitopische residuen die verschillend zijn tussen Bet v 1.0101 en Mal d 1.0101 zijn gelabeld. De overeenkomsten zijn berekend op basis van substitutiematrixscores (BLOSUM62), zoals geïmplementeerd in MOE.32

Het is waarschijnlijk dat Mal d 1 meer dan één conformationele epitoop bevat.47 Een aantal aminozuurposities die relevant zijn voor IgE-herkenning zijn geïdentificeerd door mutatieanalyses.13,34 Voor een vijfpuntsmutant van Mal d 1.0108 (Thr10→Pro, Ile30→Val, Thr57 →Asn, Thr112→Cys, en Ile113→Val) werd in vitro een duidelijk verminderd vermogen tot binding van Mald 1-specifiek IgE gevonden.34 Huidpriktesten bij appelallergische patiënten waarbij wild-type Mal d 1 werd vergeleken met de vijfpuntsmutant toonden verder een significant lager vermogen van het mutante eiwit om in vivo huidreacties te induceren.48 Verdere experimenten toonden aan dat het T-celherkenningsniveau van wild-type Mal d 1 behouden blijft in de vijfpuntsmutant.34 Omdat deze vijf aminozuren waarschijnlijk niet alleen in Mal d 1 maar ook in Bet v 1 betrokken zijn bij IgE-interacties, zouden ze wel eens deel kunnen uitmaken van gemeenschappelijke kruisreagerende epitopen in deze twee allergenen.49 Dit wordt bevestigd door mutatiestudies, die aantoonden dat peptidestroken die deze residuen omvatten inderdaad betrokken zijn bij immunologische kruisreactiviteit tussen Mal d 1 en Bet v 1.50 Bovendien werd in een onafhankelijke studie vastgesteld dat Ser111 essentieel is voor IgE-binding aan Mal d 1, en een Ser111→Cys-mutatie resulteerde in significant verminderde affiniteit voor IgE in immunoblottingexperimenten.13

Figuur Figuur 44A laat zien dat deze zes residuen tamelijk verspreid op het eiwitoppervlak van Mal d 1 liggen en dat geen van deze aminozuren overlapt met hetBV16 -epitoop. De aminozuren Thr10, Ser111 en Thr112 vormen een gemeenschappelijke laag op het eiwitoppervlak, terwijl Thr57 ongeveer 37-39 Å verwijderd is en dicht bij het BV16-epitoop ligt. Aangezien een epitoop van typische grootte (∼600-900 Å2)39 en cirkelvorm een booglengte van 28-34 Å zou hebben op het Mal d 1-oppervlak, liggen de residuen Thr10, Ser111 en Thr112 waarschijnlijk te ver weg van Thr57 om deel uit te maken van een gemeenschappelijk bindend epitoop. De overige twee residuen, Ile30en Ile113, bereiken het eiwitoppervlak niet in Mal d 1. Terwijl Ile113 in de ruimte dicht bij het Thr10-Ser111-Thr112 gedeelte ligt, wijst zijn hydrofobe zijketen naar het inwendige van het eiwit, waar het deel uitmaakt van een kleine hydrofobe kern aan het binnenste uiteinde van de holte van het eiwit (tussen schroefjes α1 en α3 en de β-sheet). Residu Ile30 bevindt zich ook in het binnenste van het eiwit, waarbij zijn alifatische zijketen deel uitmaakt van de interne holte en niet bijdraagt aan het eiwitoppervlak.

Opgemerkt moet worden dat, omdat de lus tussen de strengen β6 en β7 in Mal d 1 één residu korter is dan in Bet v 1, Ser111 en Thr112 van β7 in Mal d 1 de β7-posities innemen van Ser112 en Ile113 in Bet v 1. Het oppervlak gevormd door Thr10, Ser111 en Thr112 in Mal d 1 blijkt dus minder hydrofoob te zijn dan het corresponderende oppervlak in Bet v 1 (Thr10, Ser112 en Ile113). In feite vertoont ook het eiwitoppervlak rond deze drie residuen een aanzienlijk lagere mate van overeenkomst tussen Mal d 1.0101 en Bet v 1.0101 dan andere delen van het eiwitoppervlak, zoals te zien is in figuur 44B. Dit zou gedeeltelijk verantwoordelijk kunnen zijn voor de verschillende IgE-bindende eigenschappen van deze allergenen. Anderzijds is opgemerkt dat de epitopecoïncidentie tussen Bet v 1 en Mal d 1 beperkt kan zijn,47 zoals wordt geïllustreerd door een recente studie die de isolatie beschrijft van humaan IgE dat bindt aan Bet v 1 maar niet aan Mal d 1.51 Bovendien bevatten verschillende Mal d 1 isovormen aminozuursubstituties binnen potentiële IgE interactievlakken,39 wat suggereert dat deze de immunologische reactie kunnen beïnvloeden.

Het is duidelijk dat structuurgegevens met een hoge resolutie de basis vormen voor het bepalen en vergelijken van structurele details van (kruisreactieve) bindingsepitopen in allergene eiwitten. Bovendien is het enten van conformationele epitopen door het overbrengen van stukken residu tussen homologe allergenen een waardevol experimenteel hulpmiddel geworden. Epitope grafting werd gebruikt om de rol van de BV16 epitoop in Mal d 1 te karakteriseren door deze epitoop te creëren op het Mal d 1 oppervlak, waarbij het belang ervan voor IgE binding en kruisreactiviteit met Bet v 1 werd bevestigd.39 In een orthogonale benadering werden verschillende Mal d 1 trajecten die residuen omvatten die cruciaal zijn voor IgE binding overgebracht naar Betv 1 om de rol van deze structurele segmenten voor kruisreactiviteit te onderzoeken,50 en chimaeren van Bet v 1 en Mal d 1 werden gecreëerd om het epitoop van een humaan monoklonaal IgE, dat werd geïsoleerd uit een faagbibliotheek, in kaart te brengen op de C-terminus van Bet v 1.51 Bovendien biedt het enten van epitopen toegang tot chimeer-algen met fijnafgestemde antigene eigenschappen, zoals verminderde IgE-bindingscapaciteiten, voor op moleculen gebaseerde allergiediagnose en specifieke immunotherapie.52 Kennis van de structurele details van deze allergenen elementen is nodig om correct gevouwen chimaeren te genereren, omdat overdracht van (gedeeltelijk) mismatching stukken van secundaire structuur tussen verschillende allergenen heel goed de reden kan zijn voor een verlies van eiwitvouwing en, als gevolg daarvan, vermindering van IgE-bindende capaciteiten.41 De hier gepresenteerde driedimensionale structuur van Mal d 1.0101 biedt de biofysische basis voor het ophelderen van de moleculaire details van immunologische kruisreactiviteit in groot detail.