DISCUSSÃO
A amplificação do ácido nucleico usando RT-PCR ou outras técnicas proporciona um diagnóstico mais preciso da meningite EV do que as técnicas anteriormente disponíveis, tais como a cultura viral. Com a disponibilidade destas técnicas de diagnóstico sensíveis, muitas amostras de LCR são agora submetidas a testes de ácido nucléico EV. Temos monitorizado o perfil do LCR, incluindo a contagem de leucócitos e o nível de proteínas, para ajudar a avaliar o desempenho do EV RT-PCR utilizado no nosso laboratório. Analisámos agora os dados baseados em amostras submetidas para EV RT-PCR durante o período de 3 anos de 2001 a 2003 para reavaliar a relação entre os parâmetros do LCR e a presença de infecção EV do sistema nervoso central (SNC). Durante um desses anos, ocorreu um grande surto de VNV na nossa área, o que nos permitiu avaliar o impacto da presença de outro patogénico neurotrópico na relação entre as anomalias no perfil do LCR e a possível presença de VE RT-PCR. Os nossos resultados podem ser úteis para clínicos e trabalhadores de laboratório que procuram optimizar a sua utilização de testes de ácido nucleico EV.
O principal foco do nosso estudo foi a relação entre a contagem de leucócitos no LCR e os resultados de EV RT-PCR. Estávamos interessados em determinar a proporção de pacientes com infecção EV CNS e uma contagem elevada de leucócitos no LCR. Também estávamos interessados em determinar a proporção de pacientes com uma elevada contagem de leucócitos no LCR que foram contabilizados por infecção do VE. Os nossos dados mostram que ambas estas proporções são fortemente influenciadas pela idade. A descoberta de uma falta de pleocitose do LCR em amostras de LCR positivas para o RNA do VE foi em grande parte limitada a bebés com menos de 2 meses de idade e foi bastante comum (28%) neste grupo etário, provavelmente reflectindo a imaturidade imunológica destes pacientes. É tentador especular que uma resposta quimiocítica necessária para o recrutamento de leucócitos para o local da infecção ainda não se tinha desenvolvido nestes pacientes. Entre os doentes mais idosos, menos de 2% dos doentes com infecção EV do SNC não apresentavam pleocitose. Pelo contrário, a descoberta de pleocitose do LCR com um EV RT-PCR negativo era mais comum entre as amostras de pacientes mais velhos. Não surpreendentemente, esta descoberta também foi mais comum durante a época em que ocorreu um surto considerável de doença de VNV na área servida pelo nosso laboratório.
Estudos anteriores de menor dimensão também se concentraram numa comparação dos resultados de VE RT-PCR e parâmetros do LCR. Henquell et al. (5) relataram 61 doentes com sintomas de meningite e compararam a cultura de VE e os resultados da PCR com os resultados do LCR. Cinquenta e seis dos 61 pacientes (92%) eram positivos à PCR, mas 9 pacientes que eram >1,5 anos de idade tinham contagens de células do LCR de <10 células/mm3 e eram positivos à PCR ou cultura. Assim, no seu estudo, a correlação entre a pleocitose e a positividade EV RT-PCR não foi boa. Böttner et al. (2) relataram uma coorte de 70 pacientes com sintomas de meningite durante o Verão de 2000. Nesse estudo, 29 (46%) dos 61 ensaios EV RT-PCR sobre o LCR foram positivos. A contagem de células do LCR variou de 2 a 1.820 células/mm3, com uma média de 151. Os autores relataram que não houve diferenças nos resultados laboratoriais entre os pacientes do seu estudo que eram EV RT-PCR positivos e os que eram negativos, mas não forneceram contagens detalhadas de células do LCR. A explicação para as diferenças entre os resultados desses estudos e o presente estudo não é clara, mas poderia reflectir diferenças biológicas nos EV a serem detectados ou características de desempenho diferentes dos ensaios EV RT-PCR.
Um dos aspectos interessantes do presente estudo é focar a atenção nas causas da pleocitose do LCR em doentes cujo ensaio EV RT-PCR é negativo. Uma explicação possível é que o ensaio pode não detectar todas as infecções de VE. Não conhecemos a sensibilidade analítica (molecular) real do ensaio de quimiocitose em termos da sua capacidade de detectar baixos níveis de RNA viral. Investigámos a sensibilidade e descobrimos que é da ordem de 2,0 vezes a dose infecciosa de 50% de cultura de tecidos, mas não sabemos quantos genomas EV isto representa, nem se sabe quantas partículas não infecciosas são produzidas numa infecção aguda no LCR humano. Contudo, é pouco provável que esta seja a única explicação, uma vez que, no nosso estudo, 21 dos 148 pacientes (14%) que tinham ≤2 meses e 169 dos 549 pacientes (31%) que tinham >2 meses de idade tinham pleocitose e eram EV RT-PCR negativos. Os iniciadores e a sonda utilizados no nosso estudo demonstraram detectar todos os EV conhecidos, excepto 6 dos 64 que infectam humanos (13). Um EV, coxsackievirus A15, não estava disponível para testes, e dois outros que não foram detectados com esta combinação de primer e sonda, os equovírus 22 e 23, foram desde então reclassificados como parechovírus (16). Os seis EV que não foram detectados são epidemiologicamente raros. Outras infecções, tais como HSV, EBV, e WNV, foram diagnosticadas em alguns dos doentes com pleocitose, mas representaram apenas 18 infecções ou 23% de todos os doentes deste estudo com pleocitose e um EV RT-PCR negativo no ano 2002 (n = 77). É possível que alguns dos restantes pacientes tenham tido infecções com outros agentes infecciosos, tais como os parecovírus (16). Além disso, alguns dos casos de pleocitose observados neste estudo podem ter sido devidos a causas não infecciosas de pleocitose, incluindo reacções a medicamentos como o cotrimoxazol, agentes anti-inflamatórios não esteróides, e imunoglobulina intravenosa. A infecção do tracto urinário bacteriano também tem sido implicada como causa de pleocitose do LCR em crianças (18).
A utilização de níveis de proteína do LCR como indicador da positividade de EV RT-PCR foi considerada. Contudo, os dados mostraram que o nível de proteína do LCR não era nem sensível nem específico quando utilizado isoladamente, nem aumentava a sensibilidade ou especificidade quando utilizado em conjunto com a pleocitose. As curvas características operacionais do receptor mostraram que o nível de proteína do LCR por si só nunca teve uma especificidade superior a 80% em nenhum dos níveis de corte investigados, e em nenhum grupo etário nem em nenhum dos três níveis investigados a sensibilidade e a especificidade foram superiores a 80%. A melhor correlação entre os níveis de proteína do LCR e a positividade do EV RT-PCR ocorreu em pacientes que tinham >2 meses de idade a 80% do corte normal, onde a sensibilidade era de 68% e a especificidade era de 78%.
A circulação do WNV na comunidade durante a época do EV 2002 foi potencialmente um factor de confusão na utilização de marcadores do LCR como correlatos da positividade do EV RT-PCR. De facto, os dados do teste z do Quadro33 confirmam que houve diferenças significativas entre os dados das estações de 2001 e 2002 sobre as especificidades da pleocitose apenas ou pleocitose e/ou nível elevado de proteína como correlatos da positividade de EV RT-PCR, talvez devido à presença de WNV em St. Louis durante a estação de 2002. Em 2002, havia 67 espécimes de LCR de pacientes com >2 meses que tinham pleocitose negativa por PCR EV. Destes, 10 (15%) eram positivos para o WNV e 18 (27%) eram positivos para o WNV ou outro vírus. Se todos estes 18 falsos positivos foram retirados dos cálculos de 2002, a especificidade e o PPV aumentaram de 56% e 23%, respectivamente, para 63% e 29%. A especificidade e PPV para todos os espécimes de doentes que tinham >2 meses em 2001 eram de 62% e 66%, respectivamente. A remoção dos falsos positivos que eram atribuíveis à presença de outros vírus ainda não explica a queda do PPV de 2001 a 2002. Outros factores desconhecidos devem estar em acção. Assim, a presença de outra causa (infecciosa ou não) de pleocitose do LCR na comunidade diminui a capacidade do laboratório de prever a positividade do VE com base nos resultados do LCR.
Além de focar a atenção em outras causas de pleocitose do LCR que não a infecção do VE, os resultados deste estudo têm duas aplicações práticas. A primeira é que os laboratórios que realizam o EV RT-PCR podem utilizar a comparação dos resultados do RT-PCR com a contagem de células do LCR para desenvolver métricas que podem ser utilizadas como parte de um programa de garantia de qualidade para esse ensaio. Com base na nossa experiência, uma métrica é que o EV RT-PCR deve ser positivo em aproximadamente 75% dos bebés com menos de 2 meses de idade com pleocitose do LCR, em aproximadamente 65% dos bebés e crianças dos 2 meses aos 18 anos com pleocitose do LCR, e em aproximadamente 25% dos doentes com mais de 18 anos com pleocitose do LCR. Estes números derivam da utilização de dados das duas estações em que o WNV esteve ausente ou não era muito comum. A circulação de arbovírus conhecidos ou novos ou outros vírus que possam causar meningite deve ser considerada para a análise dos dados relacionados com esta métrica, porque irá causar uma diminuição na proporção de doentes com pleocitose que têm um resultado positivo de EV RT-PCR. Os laboratórios que não cumprem esta norma podem beneficiar da investigação da sensibilidade analítica do seu ensaio, mas também devem estar atentos à possível presença de outros agentes que possam causar pleocitose do LCR.
Uma segunda métrica que pode ser utilizada para o controlo de qualidade é que o ensaio EV RT-PCR deve ser negativo em aproximadamente 98% dos doentes com mais de 2 meses de idade que não tenham pleocitose do LCR, e em aproximadamente 70% dos doentes com menos de 2 meses de idade sem pleocitose. A detecção de RNA EV numa maior percentagem de doentes que não têm pleocitose deve levar os laboratórios a considerar se a contaminação por PCR pode estar presente. Deve notar-se, contudo, que estas percentagens irão provavelmente variar de uma região para outra, de uma população de doentes para outra, de um ensaio diagnóstico para outro, e de uma estação para outra, possivelmente dependendo do EV que circula.
A segunda aplicação prática dos resultados deste estudo é que os laboratórios podem utilizar estes dados para estabelecer critérios para maximizar a eficiência dos testes EV RT-PCR. Por exemplo, como a ausência de pleocitose tem um valor preditivo superior a 98% para um resultado negativo de RT-PCR em pacientes com mais de 2 meses de idade, os laboratórios podem optar por estabelecer um corte para o teste de EV RT-PCR com base na presença ou ausência de pleocitose. Utilizando os dados do presente estudo, a aplicação deste corte teria resultado na exclusão de 223 de 549 amostras (com base nas 549 amostras de pacientes que estavam >2 meses de idade para os quais estavam disponíveis contagens de células do LCR), com uma falha na detecção de apenas 3 amostras positivas (1,3%) que teriam estado no grupo excluído de 223 amostras. Os três doentes com infecção EV mas sem pleocitose tinham 5 meses, 10 anos, e 15 anos de idade. Um destes pacientes (o de 10 anos) era suspeito de ter meningite EV em virtude de um pescoço rígido, mas os outros dois tinham sintomas que estavam menos claramente associados à meningite. O paciente de 10 anos de idade teria provavelmente sido testado para EV com base na suspeita clínica e não na pleocitose do LCR, mas os outros dois poderiam não ter sido testados. Para os três casos, o resultado positivo de PCR EV não teve um impacto significativo na gestão do caso. Se uma medida como a que sugerimos for adoptada, recomendamos a sua aplicação a doentes com mais de 2 meses de idade e a garantia de que existe um mecanismo que permitiria testar em casos individuais com forte suspeita clínica de infecção por EV, independentemente da idade do doente ou da presença de pleocitose do LCR. Obviamente, um programa de rastreio baseado na pleocitose do LCR é prático apenas para laboratórios cujo acesso aos dados de contagem de células do LCR seja suficientemente rápido para que a aplicação do critério de rastreio não atrase a realização do ensaio. Estudos anteriores demonstraram claramente que os ensaios EV devem ser realizados de forma muito atempada, a fim de terem um impacto na tomada de decisões clínicas (14).