Resultados e Discussão
A estrutura tridimensional do Mal d 1.0101 consiste de uma folha curva, antiparalela de sete cordas β-sheet (β1-β7) embracinga longa hélice no termo C da proteína (α3) e duas helices de curta duração consecutivas (α1, α2) (Figura11). Os bordos da folha β são formados por cordões β1 e β2, que são ligados por helices α1and α2 que formam um suporte em forma de V para a hélice da parte terminal da proteína C α3. No total, Mal d 1 contém cerca de 35% de folha β e cerca de 25% de estrutura helicoidal, concordando bem com a estrutura secundária, que é estimulada pelo dicroísmo infravermelho e circular.33-35 Tal como noutras proteínas da família PR-10, os fios β2 e β3 estão ligados por um motivo de laço rico em glicina (Gly46-Asn47-Gly48-Gly49-Pro50-Gly51).Juntos, estes elementos estruturais criam a grande cavidade interna que é típica da dobra canónica PR-10. Da Figura11B é evidente que no nosso conjunto estrutural de Mal d 1 da RMNMR, os elementos estruturais secundários são muito bem definidos e confortavelmente homogéneos nos 20 modelos estruturais. Apenas níveis ligeiramente elevados de heterogeneidade conformacional são observados para alguns dos loops expostos a solventes que ligam os elementos da estrutura secundária e o termo C da proteína.
Uma característica peculiar da dobra PR-10 é a grande cavidade interna.No Mal d 1.0101, o volume desta cavidade36 é ca. 2230 Å3, que é comparável em tamanho aos de outras proteínas PR-10.5 Como se encontra no alergénio do pólen Bet v 1 e outros alergénicos alimentares homólogos, no Mal d 1 a maioria dos aminoácidos que formam a superfície da cavidade são hidrofóbicos (Figura22). Uma grande proporção da superfície da cavidade interna é formada por resíduos de aminoácidos na folha β, cujas cadeias laterais hidrofóbicas se encontram no interior da proteína (Ile56 (β3), Val67(β4), Ile71 (β4), Tyr81 (β5), Tyr83 (β5),Leu85 (β5), Ile98 (β6), Tyr100 (β6), Ile113 (β7))juntamente com os resíduos de ponta de dentro na longa anfíbilia helixα3 (Val132, Val134, Ala139, Leu142, Phe143, Ile146), as duas helices α1 (Phe22, Val23) e α3 (Ala26, Ile30),e as regiões de loop (Ile38, Phe58, Tyr64, Ala90). Além disso, algumas cadeias laterais polares e carregadas estão localizadas no interior da molécula e fazem parte da superfície da cavidade, tais como Asp27 (α2), His69(β4), Ser115 (β7), e Lys138 (α3), de modo que a própria cavidade é na realidade anfifílica, como já foi referido anteriormente para o alergénio de pólen majorbirch, Bet v 1,37 Nas estruturas cristalinas de outras proteínas PR-10 a cavidade é ocupada por água, moléculas de ligante anfifílico, ou componentes do tampão de cristalização.5 Para Mal d 1, não se sabe actualmente se os ligandos se ligam especificamente à cavidade ou qual a função teológica da ligação dos ligandos.
(A) Cavidade interna de Mal d 1.0101, colorida de acordo com o potencial lipofílico implementado em MOE,32 onde as regiões lipofílicas são coloridas a azul e as regiões lipofílicas são coloridas a amarelo. (B) Representação da superfície da estrutura de energisolução mais baixa de Mal d 1.0101. As duas entradas anfifílicas da cavidade interna são indicadas como ε1 (entre a extremidade terminal N da hélice α3 e os laços de ligação dos fios β3-β4and β5-β6) e ε2 (entre a extremidade terminal theβ-sheet e a extremidade terminal C da hélice α3).
A cavidade interna em Mal d 1 pode ser alcançada por duas aberturas (Figura22). Uma entrada para o interior da proteína, ε1, é moldada por resíduos na metade terminal da hélice N α3 (His131, Val134) juntamente com os laços de ligação β3-β4 (Gln63, Tyr64) e os fios β5-β6(Asp89). Juntos, estes aminoácidos criam uma rota de acesso anfifílico ao interior da proteína. Uma segunda entrada anfifílica, ε2,está presente na borda da folha β entre a hélice α3(Lys136, His140, Lys144, e Glu147) e o cordão β1 (Asn7, Phe9,e Ser 11). Na solução NMR estruturas de Mal d 1 esta via de acesso é parcialmente obstruída pela cadeia lateral do His140. De notar que as entradas na cavidade interna em locais semelhantes foram também descritas para outros membros da família de proteínas PR-10.5
Figure Figure33 mostra uma comparação de Mal d 1 com Bet v 1 e alergénios alimentares relacionados com pólen de bétula da família PR-10 cujas estruturas foram determinadas até agora.Apesar do facto de as identidades sequenciais entre estas proteínas serem apenas ligeiramente superiores a 50% em alguns casos, as suas estruturas tridimensionais são geralmente muito semelhantes, com valores rmsd da espinha dorsal para estruturas secundárias tipicamente abaixo de 2 Å.38 À luz da reactividade cruzada imunológica observada entre o Mal d 1 e o principal alergénio do pólen de bétula, Bet v 1, a comparação estrutural destas duas proteínas é de particular interesse. O backbonermsd entre Mal d 1.0101 e a isoforma hiperalergénica Bet v 1.0101(61% de identidade sequencial) do alergénio de pólen de bétula é 2.13 Å(1.70 Å para elementos de estrutura secundária). De notar que Mal d 1 eBet v 1 diferem em comprimento por um aminoácido, e foram feitas presunções divergentes sobre a localização da lacuna em Mal d 1. Com base nos alinhamentos sequenciais dos alergénios alimentares PR-10, foi proposto que ou o laço mesmo antes de 39,40 ou logo após 4,34,41,42 fio β7 é um resíduo mais curto em Mal d 1. A nossa estrutura de solução mostra que o laço mesmo antes do cordão β7 é o mais curto em Mal d 1,0101. Os cordões β6 (Glu96-Val105 em Mal d 1.0101 e Bet v 1.0101) e β7 (Ser111-Thr121 em Mal d 1.0101 e Ser112-Thr122 em Bet v 1.0101) ocupam posições idênticas e têm padrões de ligação de hidrogénio iguais nas folhas antiparallelβ destas proteínas. Estão ligadas através de loops constituídos por quatro resíduos (Cys-Gly-Ser-Gly em Mal d 1) e cinco resíduos (Thr-Pro-Asp-Gly-Glyin Bet v 1), respectivamente, o que produz uma pequena diferença estrutural nestes segmentos de loop entre as duas proteínas.
Comparação de alergénios alimentares e vegetais PR-10 com estruturas conhecidas.(A) Sobreposição da estrutura energética mais baixa de Mal d 1.0101 (verde,código de adesão PDB 5MMU) com as estruturas do principal alergénio de bétula Bet v 1.0101(azul, 4A88), o alergénio de cenoura Dau c 1.0103 (laranja, 2WQL), o alérgeno de azeitona Api g 1.0101 (cinza, 2BK0), o alergénio de soja Glym 4.0101 (amarelo, 2K7H), o alergénio de morango Fra a 1E (vermelho, 2LPX), e o alergénio de cereja Pru av 1.0101 (púrpura, 1E09). (B) O alinhamento multiplesequência destes alergénios obtidos com Clustal Omega.53 Os aminoácidos são marcados com asteriscos (idênticos), cólons (conservados), e pontos (semiconservados). As estruturas secundárias presentes no Mal d 1.0101 são indicadas.
Mal d 1 é conhecido por ter uma tendência para a cisteina-mediata dimerização, como mostrado para a isoforma Mal d 1.0108 por electroforese de gel não redutor e cromatografia de exclusão de tamanho.35 Tal como o Mal d 1.0108, a isoforma Mal d 1.0101 contém um único cisteineresidue, Cys107. Na estrutura tridimensional da solução de Mald 1.0101 Cys107 está localizada na ponta terminal do cordão C β7, com a sua cadeia lateral orientada para a superfície da proteína. Para sondar o estado de oligomerização de Mal d 1.0101 nas condições que empregamos para a determinação da estrutura NMR (pH 6,9, 10 mM fosfato de sódio, 14 mol equiv. de ácido l-ascórbico, 298 K) realizámos experiências de difusão NMR de grau de combustão pulsante. Obtivemos um valor de 21,6 ± 0,8 Å para o raio hidrodinâmico do Mal d 1,0101,que é comparável ao raio hidrodinâmico do Monomeric Bet v1.0101 (20,1 Å) em condições experimentais semelhantes.21 Isto é consistente com a nossa observação de que, utilizando o mesmo tampão, o Mal d 1,0101 elui de uma exclusão de tamanho a frio com um tempo de retenção praticamente idêntico ao do Bet v1.0101. Estes resultados foram ainda verificados pela espectrometria de massa FT-ICR,que mostra que Mal d 1.0101 não forma dímeros ou ordenagregados superiores.
A estrutura da solução NMR de Mal d 1 mostra que esta proteína consiste de um antiparalelo altamente curvo β-folha e três α-helicesformando uma grande cavidade interna, muito semelhante na moda a outras proteínas PR-10.5 Isto está de acordo com a reactividade cruzada imunológica observada entre o Mal d 1 e o principal alergénio do pólen de bétula, Bet v 1, bem como outros alergénicos alimentares da família de proteínas PR-10.4,43 Na maioria dos doentes, Betv 1 é o agente sensibilizante, enquanto Bet v 1 específico IgE antibodiessubsequentemente reage de forma cruzada com Mal d 1 e suscita uma resposta alérgica, como reflectido pela observação clínica de que a alergia à maçã só se desenvolve após o início da polinose de bétula.44
Ao longo destas linhas, experiências de inibição cruzada de Mal d 1usingsera de doentes alérgicos à maçã mostraram que Mal d 1 partilha epitopos IgE com o principal alergénio de pólen de bétula, Bet v 1.4,43 Froma perspectiva estrutural, informação limitada sobre a natureza exacta dos epitopos de ligação de Mal d 1 e Bet v 1 está disponível. Informação estrutural detailedstructural sobre um sequencialmente descontínuo (i.e, conformational)B-cell epitope em Bet v 1 foi obtido pela cocritização do particularisofórmio Bet v 1,0112 com um fragmento de ligação ao antigénio (Fab) derivado do anticorpo monoclonal murino IgG BV16.45 Este epitópo é formado pelo segmento entre Glu42 e Thr52 (incluindo o motivo do laço rico em glicina entre os fios β2 e β3),juntamente com Arg70, Asp72, His76, Ile86, e Lys97 de Bet v 1, cobrindo aproximadamente 10% (≈900 Å2) de toda a superfície proteica. A ligação do BV16 a este epitopo reduz de forma mensurável as interacções de IgE, indicando que IgE e IgG BV16 monoclonal competem por superfícies de ligação sobrepostas no Bet v 1.46 Além disso, a mutação de um resíduo central (Glu45→Ser) reduziu significativamente a capacidade de ligação de IgE do Bet v 1, confirmando o significado deste epitopo em particular para as interacções com IgE.46
Figure Figura44A mostra a superfície de interacção molecular que corresponde à epitopeína BV16 do alergénio de maçã. Em Mal d 1 estes resíduos formam uma mancha de superfície contígua juntamente com um resíduo algo distal (Glu76), de forma e tamanho semelhantes ao do epitopo BV16 de Bet v 1. Além disso, os ácidos que contribuem para a formação de aminoácidos são em grande parte conservados entre Mal d 1 e Bet v 1. Treze dos 16 aminoácidos do epitópo BV16 são idênticos, enquanto que apenas3 resíduos são diferentes em Mal d 1.0101 e Bet v 1.0101 (Figura44B). Estes dados fornecem assim uma justificação estrutural para a reactividade cruzada alérgica observada entre o pólen de bétula e os alergénios de maçã. Curiosamente, os estudos de mutações indicam que a capacidade do Mal d 1 de ligar o soro IgE dos pacientes com alergias ao pólen de bétula pode ser aumentada aumentando a semelhança do epitopo BV16 em Mal d 1 com o do Bet v 1, indicando que estes aminoácidos estão de facto envolvidos na ligação deBet v 1 específica ao Mal d 1.39
É provável que Mal d 1 contenha mais do que um único sepitope conformacional.47 Uma série de posições de aminoácidos relevantes para o reconhecimento de IgE foram identificadas por análise mutacional.13,34 Para um mutante de cinco pontos de Mal d 1.0108(Thr10→Pro, Ile30→Val, Thr57 →Asn, Thr112→Cys,e Ile113→Val) foi encontrada in vitro uma capacidade marcadamente reduzida de ligação da IgE específica do Mal d 1.34 Os testes de picada de pele em doentes alérgicos à maçã comparando o Mal d 1 do tipo selvagem com o mutante de cinco pontos mostraram ainda uma capacidade significativamente menor da proteína mutante para induzir reacções cutâneas in vivo.48 Outras experiências mostraram que o nível de reconhecimento de células T do Mal d 1 do tipo selvagem é conservado no mutante de cinco pontos.34 Como estes cinco aminoácidos estão provavelmente envolvidos nas interacções IgE não só no Mal d 1 mas também no Bet v 1, o microrganismo pode muito bem fazer parte dos epitopos de reacção cruzada comuns nestes dois alergénios.49 Isto é corroborado por estudos de mutação, que mostraram que as estirpes de peptídeo que englobam estes resíduos estão de facto envolvidas em reactividade cruzada imunológica entre Mald 1 e Bet v 1.50 Além disso, num estudo independente, o Ser111 foi identificado como sendo essencial para a ligação de IgE a Mal d 1, e uma mutação em Ser111→Cys resultou numa afinidade significativamente reduzida para IgE em experiências de immunoblotting.13
Figura Figura44A mostra que estes seis resíduos estão bastante dispersos na superfície proteica do Mal d 1 e que nenhum destes aminoácidos se sobrepõe ao epitopoBV16. Os aminoácidos Thr10, Ser111, e Thr112 formam um lote comum na superfície da proteína, enquanto que o Thr57 está localizado aproximadamente a37-39 Å e próximo do epitópo BV16. Considerando que um epitópo de tamanho típico (∼600-900 Å2)39 e forma circular teria um comprimento de arco de 28-34 Å na superfície Mal d 1, resíduos Thr10, Ser111, e Thr112 estão provavelmente demasiado longe de Thr57 para fazer parte de um epitópo de ligação comum. Os dois restantes resíduos, Ile30e Ile113, não atingem a superfície proteica em Mal d 1. Enquanto a Ile113 está próxima no espaço da mancha Thr10-Ser111-Thr112, a sua cadeia hidrofóbica lateral está a apontar para o interior da proteína, onde participa num pequeno núcleo hidrofóbico localizado no interior da cavidade das proteínas (entre helices α1 e α3and a folha β). O resíduo Ile30 também está localizado no interior da proteína com a sua cadeia lateral alifática formando parte da cavidade interna e não contribui para a superfície da proteína.
Of nota,porque o laço entre os cordões β6 e β7is é mais curto por um resíduo em Mal d 1 do que em Bet v 1, Ser111 e Thr112of β7 em Mal d 1 ocupam as posições β7 de Ser112 e Ile113 em Bet v 1. A mancha de superfície formada por Thr10, Ser111, e Thr112 em Mal d 1 parece assim ser menos hidrofóbica que a mancha de superfície correspondente em Bet v 1 (Thr10, Ser112, e Ile113). De facto, também a superfície proteica em redor destes três resíduos apresenta um nível de semelhança consideravelmente menor entre Mal d 1.0101 e Bet v 1.0101 do que outras partes da superfície proteica, como pode ser visto na Figura44B.Isto pode ser em parte responsável pelas diferentes propriedades de ligação IgE destes alergénios. Por outro lado, foi observado que a epitopecoincidência entre Bet v 1 e Mal d 1 pode ser limitada,47 como exemplificado por um estudo recente que descreve o isolamento da ligação de IgE humana à Bet v 1 mas não à Mal d 1.51 Além disso, diferentes isoformas de Mal d 1 contêm substituições de aminoácidos dentro de potenciais superfícies de interacção IgE,39 sugerindo que podem influenciar a reacção imunológica.
É evidente que os dados estruturais de alta resolução fornecem a base para determinar e comparar os detalhes estruturais de bindingepitopes (reactivos cruzados) em proteínas alergénicas. Para além disso, a enxertia de sepitopos conformacionais através da transferência de extensões de resíduos entre alergénios homólogos tornou-se uma ferramenta experimental valiosa. O enxerto de epitopos foi utilizado para caracterizar o papel do epitopo BV16 em Mal d 1 ao criar este epitopo na superfície de Mal d 1, confirmando a sua importância para a ligação e reactividade cruzada de IgE com Bet v 1.39 Numa abordagem ortogonal, vários trechos de Mal d 1 que são cruciais para a ligação IgE foram transferidos para Betv 1 para investigar o papel destes segmentos estruturais na reactividade cruzada,50 e quimeras de Bet v 1 e Mal d 1 foram criadas para mapear o epítopo de uma IgE monoclonal humana, que foi isolada a partir da biblioteca de fago, para o termo C de Bet v 1.51 Além disso, a enxertia epitopal dá acesso a quimeroalergênicos com propriedades antigénicas afinadas, tais como capacite reduzida de IgEbinding, para diagnóstico de alergia à base de moléculas e imunoterapia específica.52 O conhecimento dos detalhes estruturais destes elementos alergénicos é necessário para gerar quimeras correctamente dobradas, porque a transferência de estiramentos (parcialmente) inadequados da estrutura secundária entre diferentes alergénios pode ser a razão para uma perda de dobras proteicas e, consequentemente, uma redução das capacidades de ligação de IgE.41 A estrutura tridimensional de Mal d 1.0101 aqui apresentada fornece a base biofísica para elucidar os detalhes moleculares da reactividade cruzada imunológica em grande detalhe.