DISCUSSÃO

Neste estudo, apresentamos estruturas de solução SAXS para Hb e Hb conjugadas com duas ou seis a sete cópias de PEG 5-kD. Este é o primeiro exemplo de uma determinação estrutural em 3D de uma hemoglobina conjugada com PEG, embora com uma resolução baixa. As conclusões mais importantes deste estudo são: i), a conjugação de PEG não induz qualquer distorção grosseira da estrutura terciária do Hb (nesta resolução), mas a sua estrutura quaternária parece compactada; ii), parte das cadeias de PEG entra em cavidades entre as subunidades do Hb, parte permanece perto da superfície proteica, e o resto sobressai da superfície; iii), o PEGylation transforma a molécula esférica de Hb numa estrutura alongada com dois ou seis PEG conjugados; iv), a conjugação de PEG leva à repulsão entre as moléculas de Hb PEGylated causadas pela camada de PEG que envolve a proteína Hb, que se manifesta por um efeito de concentração marcado nos dados SAXS.

A dispersão experimental de Hb é bem ajustada pela curva calculada a partir da estrutura cristalina de oxyHb, enquanto que a estrutura cristalina deoxyHb produz um encaixe pior. Tanto P5K2 como P5K6 são conjugados em Cys-β93 adjacente à his-β92 proximal, que é o único resíduo nas subunidades de Hb directamente coordenadas com o ferro heme β. Parece provável que a junção de um PEG 5-kD cause distorções estruturais locais e menores da bolsa de heme de β-subunit que não são detectáveis nesta resolução (∼12 Å). Isto é apoiado por estudos de cinética de perda heme que são 5 vezes superiores para a subunidade β de P5K6 em comparação com Hb não conjugado, enquanto que as subunidades α mostram cinética semelhante a Hb (8). Consistente com esta interpretação, estudos de 1H NMR de um Hb conjugado com PEG, que é semelhante em estrutura química ao P5K6 aqui estudado, mostraram uma mudança na histidina proximal do β- mas não do α-subunidades (28). Além disso, os resíduos nas proximidades de Cys-β93 estão localizados numa região conformavelmente plástica que está directamente ligada às propriedades alostéricas do Hb (29,30).

Modificação dos resíduos de Cys-β93 apenas com N-etil maleimida causa uma perda de cooperatividade, e este efeito, juntamente com a compactação da estrutura quaternária, pode explicar a aparente perda de cooperatividade em Hemospan (5). O movimento quaternário pode ser restringido, dando origem a uma transição apenas parcial entre os estados R e T ou a uma estrutura quaternária intermédia. Tal efeito foi considerado anteriormente para interpretar a cinética da ligação de O2 a Hemospan (7).

Dado que as porções de grande angular da dispersão de Hb e PEG-Hb coincidem, podem ser excluídas alterações significativas da estrutura terciária/secundária devido à PEGylation, e os nossos resultados apontam assim para uma estrutura quaternária mais compacta da proteína PEGylated. Isto pode ser explicado por uma desidratação parcial das interfaces intersubunidades causada pelas cadeias de PEG, que estão, de forma bastante inesperada, parcialmente localizadas no interior do PEG-Hbs. A estrutura quaternária do oxyHb cria uma cavidade central entre as quatro subunidades de hemoglobina. A cavidade pode acomodar pelo menos 80 moléculas de água, como demonstrado na estrutura cristalina de alta resolução do oxyHb (27). Consequentemente, o volume é suficiente para o PEG entrar na interface intersubunidade e deslocar moléculas de água localizadas no interior do tetrâmero. Além disso, o PEG é conhecido por causar desidratação e é frequentemente utilizado como cosolvente para cristalização de proteínas. Em conjunto com o deslocamento de moléculas de água localizadas na cavidade central, uma desidratação geral pode contribuir para a estrutura quaternária compacta do PEG-Hbs. Esta conclusão é consistente com simulações moleculares dinâmicas que mostraram uma correlação entre a extensão da PEGylation e o volume molecular do PEG-Hb, com um deslocamento correspondente de moléculas de água da estrutura do Hb (31).

Uma vez que a maior parte das cadeias de PEG está localizada fora do Hb, os nossos resultados concordam com estudos anteriores que mostram que o PEG é preferencialmente excluído das proteínas por exclusão estérica (32). Além disso, mas em competição com as forças de exclusão, o PEG tem demonstrado interagir com resíduos de superfície de proteínas não polares (32), e a interacção de PEG de 5-kD tem sido relatada para clusters hidrofóbicos na superfície do citocromo c (33). A pontuação de hidrofobicidade para Hb foi calculada de acordo com Kyte e Doolittle (34) (Fig. 6), mostrando números de resíduos alinhados com segmentos helicoidais. Uma região de particular interesse em possíveis interacções PEG-Hb está sobre as hélices relativamente hidrofóbicas G-H na α1β1 packing contacts between dimers. Os nossos modelos mostram interacções de superfície de PEG com Hb, embora a resolução seja insuficiente para definir os resíduos de Hb envolvidos ou a sua polaridade. A análise dos espectros SAXS registados a uma concentração relativamente elevada de proteínas mostra um claro efeito de concentração tanto para P5K2 como para P5K6, enquanto que este efeito está quase ausente em Hb não conjugado. Como seria de esperar, o efeito de concentração é mais pronunciado para P5K6 do que para P5K2, sugerindo que a introdução de cadeias adicionais de PEG resulta numa melhor protecção da molécula de Hb, também de acordo com os cálculos de dinâmica molecular das Hbs teóricas conjugadas com PEG (31).

Intuitivamente, seria de esperar que o PEG-Hbs tivesse a mesma forma que o Hb não conjugado com PEG, mas aqui mostramos que a forma de uma proteína PEGylated não é definida pela da proteína do núcleo. A forma da solução não esférica da PEG-Hbs não foi antecipada e fornece nova informação através da qual se pode calcular as constantes de difusão de PEG-Hb usando a equação de Stokes-Einstein. Relatámos simulações de transporte de oxigénio por Hbs livre de células, incluindo PEG-Hb, onde a difusão molecular de Hb demonstrou ser um factor crítico no transporte global de oxigénio (35). Embora a conclusão se mantenha, este estudo utilizou a hipótese simplificadora de que as moléculas de Hb eram esféricas. Uma vez que a estrutura da solução SAXS contradiz esta suposição, as dimensões moleculares correctas podem agora ser utilizadas para fornecer simulações mais precisas.

Outras, embora tanto P5K2 como P5K6 tenham formas semelhantes e dimensões globais, a diferença no efeito repulsivo das partículas em solução fornece uma propriedade altamente crítica que pode explicar alguns dos efeitos positivos do PEGylated Hbs in vivo. A generalidade destas observações pode ser atribuída às cadeias de PEG anexas e sugere que o efeito de concentração é uma consequência geral da conjugação de PEG. Assim, in vivo, pode-se levantar a hipótese de que este efeito não só previne interacções intermoleculares entre proteínas conjugadas com PEG adjacentes, mas também entre proteínas conjugadas e não conjugadas ou mesmo estruturas celulares.

Benefícios gerais universais, tais como aumento do tempo de retenção intravascular, diminuição da imunogenicidade, e melhoria da solubilidade, estão frequentemente associados à ligação de um polímero de PEG a uma proteína. Por exemplo, a ligação de um polímero de PEG ramificado 40-kDa a interferon-β-1b melhorou acentuadamente a sua meia-vida circulante de 1,1 h para a proteína não conjugada para 9,4 h para o fármaco conjugado com PEG; além disso, a ligação de PEG diminuiu drasticamente a imunogenicidade da proteína e a tendência para a agregação (4). A capacidade do PEG-Hb de excluir outras proteínas ou células dentro do seu volume excluído é particularmente crítica na concepção da terapêutica do oxigénio. Os produtos à base de hemoglobina estão a ser optimizados para alargar o tempo de circulação, ao mesmo tempo que minimizam ou eliminam a toxicidade. Este resultado é consistente com a semi-vida circulatória prolongada do Hemospan, que é ∼20 h na ausência de hemoglobinúria (14), em comparação com a muito rápida depuração renal de Hb não modificada, livre de células (36). O prolongamento do tempo de circulação da Hemospan pode surgir se não se ligar ao receptor de macrófago CD163, um necrófago de Hb que mostra uma ligação progressivamente decrescente de Hbs polimerizado com tamanho crescente (37). Estão em curso estudos com Hemospan neste sistema. Além disso, a repulsão de PEG-Hb de outras células imunitárias pode ser crítica para evitar respostas inflamatórias. As teorias predominantes sobre vasoconstrição induzida por hemoglobina livre de células são que as moléculas de Hb se aproximam muito do endotélio (38) ou extravasam através do endotélio (39), qualquer uma das quais tornaria mais eficiente a procura de NO, levando assim a um aumento do tónus vascular e efeitos secundários negativos da hipertensão e diminuição da perfusão (40). Continua a ser especulativo neste ponto, mas a natureza repulsiva da modificação do PEG pode reduzir a sua interacção com a glicocalia superficial das células endoteliais; assim, o efeito repulsivo fornece uma explicação para a menor vasoactividade com Hemospan (10).

Estes novos conhecimentos desta análise SAXS podem agora ser utilizados para conceber o PEG-Hbs para efeitos de repulsão máximos ou óptimos e tamanho das partículas e conformações do PEG. As forças repulsivas intermoleculares aumentam substancialmente com a massa total de PEG conjugados com o mesmo comprimento de polímero (10 vs. ∼30 kD para P5K2 versus P5K6), um efeito que não foi previsto por alterações na forma molecular e/ou dimensões. Assim, as conformações da solução dos PEG conjugados, que inclui a sua interacção com Hb, outros polímeros de PEG, e camadas de água circundantes, devem desempenhar um grande papel no efeito de repulsão.

Comprimento efectivo do PEG são definidos pela dimensão Flory, RF, que é determinada a partir do comprimento efectivo de uma unidade de oxietileno, a = 3.5 Å (41), e o número de unidades por polímero, N (42-44):

As dimensões relativas de RF e a distância entre os locais de enxertia de PEG, DG, numa superfície determinam a estrutura secundária do polímero de PEG enxertado: para DG > RF, o polímero de PEG é capaz de se dobrar sobre a superfície enxertada, dando uma conformação “cogumelo”; para DG < RF, os PEG tornam-se alargados devido a interacções estéreis entre cadeias de PEG para formar uma conformação “pincel”; e na DG ≈ RF, os PEG estão numa fase de transição “cogumelo a pincel” (45). Para PEG 5-kD, N = 113 e RF ∼ 60 Å. Uma vez que a DG de circunferência semimáxima na superfície do Hb de um Cys-β93 para o outro no lado simetricamente oposto do Hb é ∼110 Å, DG > RF, permitindo assim uma conformação em forma de cogumelo dos polímeros de PEG enxertados em P5K2. Isto reflecte-se nas características do PEG da estrutura SAXS de P5K2, mostrando uma forma elipsoidal global com Dmax = 115 Å. O cálculo do diâmetro máximo para P5K2 usando a dimensão Flory para PEG 5-kD dá uma molécula com Dmax ∼ 190 Å (isto é.., Diâmetro Hb = 70 Å + PEGs, 2 × 60 Å), fornecendo assim uma estimativa para a conformação dos cogumelos das cadeias de PEG em P5K2 que dobram para β93% das suas dimensões Flory completas.

A molécula P5K6 mais altamente coordenada com PEG contém os dois sítios de fixação específicos (Cys-β93) e mais quatro a cinco sítios de PEG enxertados. A estrutura da solução SAXS implica que as cadeias de PEG de P5K6 têm uma maior interacção estéril para formar uma forma ainda mais alongada em comparação com o P5K2 (Fig. 4). Usando uma aproximação de que as cadeias de PEG são distribuídas uniformemente pela superfície de Hb, a DG é reduzida para ∼55 Å, e a DG ≈ RF, sugerindo assim uma conformação de PEG mais extensa mas ainda numa transição de cogumelo para pincel. Usando a dimensão Flory máxima em comparação com a Dmax medida = 130 Å, as cadeias de PEG 5-kD em P5K6 parecem dobrar-se para ∼70% da sua dimensão Flory completa, consistente com um aumento na extensão de PEG em P5K6 em comparação com P5K2 por restrições estéreis.

Por determinação directa da dimensão das partículas pela SAXS combinada com a análise Flory, previmos que o P5K6 se encontra numa transição de escova de cogumelos, pelo que não foi concebido para atingir a sua dimensão máxima de partícula quando os PEG conjugados são totalmente estendidos. Novas moléculas de PEG-Hb podem ser concebidas para partículas maiores, de modo que o DG < RF ou por: 1), criando um Hb mais altamente conjugado com mais sítios de fixação de PEG, diminuindo assim o DG, ou 2), aumentando o comprimento do PEG, aumentando assim a RF. A duplicação do tamanho do PEG para 10 kD (ou seja, P10Kx, onde x é o número de sítios de conjugação), aumenta a RF para ∼90 Å, que prevemos que proporcionaria uma conformação de cogumelos em P10K2, mas que se aproximaria de uma conformação de escova mais completa em P10K6. No entanto, desconhece-se como a extensão do comprimento do polímero PEG altera as interacções estéreis durante a reacção de conjugação química PEG-Hb, pelo que novos desenhos justificam a prática experimental com rácios de reacção em conjunto com estudos SAXS para verificar o ponto de transição de cogumelo para pincel.